Summary
מאמר זה מתאר שיטות שונות של גידול
Abstract
Biofilms חיידקי נקשרו עם מספר מחלות אנושיות שונות, אבל פיתוח biofilm יש בדרך כלל נחקרה על משטחים שאינם חיים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקולים biofilms להרכיב Pseudomonas aeruginosa על תאים אנושיים אפיתל דרכי הנשימה (תאים CFBE) גדל בתרבות. בשיטה הראשונה (כינה את המודל הסטטי שותף תרבות biofilm), עמ ' aeruginosa הוא מודגרות עם תאים CFBE גדל כמו monolayers ומחוברות על צלחות תרבות תקן רקמות. למרות החיידק הוא רעיל למדי לתאי האפיתל, תוספת של עיכובים ארגינין הרס monolayer מספיק זמן בשביל ליצור biofilms על תאים CFBE. השיטה השנייה (המכונה תא זרימה משותפת תרבות דגם biofilm), כולל התאמה של מנגנון הזרימה תא biofilm, המשמש לעתים קרובות biofilm מחקר, כדי להתאים coverslip זכוכית תמיכה monolayer ומחוברות של תאים CFBE. Monolayer זה מחוסן עם פ aeruginosa ומשאבה peristaltic אז זורם בינוני טרי על פני התאים. שתי המערכות, biofilms חיידקי טופס בתוך 6-8 שעות לאחר חיסון. ויזואליזציה של biofilm מוגברת על ידי שימוש P. זנים aeruginosa constitutively לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). סטטית תזרים Co-Cell תרבות מבחני biofilm הן מערכות מודל פ מוקדם aeruginosa זיהום של הריאות סיסטיק פיברוזיס (CF), ואת הטכניקות הללו מאפשרים היבטים שונים של פ biofilm aeruginosa היווצרות ארסיות להיחקר, כולל cytotoxicity biofilm, מדידת biofilm CFU, והכתים באופן חזותי biofilm.
Protocol
1. Biofilm סטטי שותף תרבות דגם
- מודל סטטי שותף תרבות biofilm 1 משתמש CFBE41o תאים (תאים CFBE), אשר הנציח תאים שפותחו במקור עבור CF עם הומוזיגוטים למוטציה ΔF508-CFTR 2,3,4 מן הפרט. תאים CFBE צריך להיות seeded בריכוז של 10 6 תאים / היטב צלחת 6-היטב בתרבות רקמה או 2 X 10 5 צלחת 24 גם רקמת תרבות מדיום חיוני מינימלי (מ) בתוספת סרום 10% שור עוברית, 2mm L-גלוטמין, 50 U / mL פניצילין, ו -50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין. אנו משתמשים בינוני 1.5 מ"ל לכל היטב צלחות 6-היטב בינוני 0.5 מ"ל לכל 24 היטב גם הצלחות.
- תאים צריך להיות גדל ב 37 ° C ו 5% CO 2 באוויר -95% במשך ימים 7-10 כדי ליצור monolayer ומחוברות לפני חיסון עם חיידקים. המדיום צריך לשנות כל 2-3 ימים. תנאים אלה הוכחו להוביל להיווצרות של monolayer ומחוברות וצמתים חזק.
- לגדול P. aeruginosa ב LB 5 מ"ל במשך 18 שעות על 37 מעלות צלזיוס שייקר אינקובטור בסל"ד 200. בתנאים אלה, פ תרבויות aeruginosa יהיו בדרך כלל להגיע צפיפות 5x10 9 CFU / ml.
- לקבלת חיסון חיידקי, להסיר את המדיום מתאי CFBE ולהוסיף נפח שווה של ממ ללא פנול אדום, בתוספת 2 מ"מ L-גלוטמין (בינוני מיקרוסקופית). Monolayers CFBE ומחוברות הם מחוסן עם פ aeruginosa על ריבוי יחסי של זיהום של כ 30:1 למספר תאים CFBE seeded במקור. זה משווה ל 2 X 10 7 CFU / mL ב 1.5 מ"ל ממ / היטב היטב 6 צלחות 1.2 X 10 7 CFU / mL ב 0.5 מ"ל ממ / טוב 24 גם הצלחות.
- דגירה צלחות במשך שעה 1 ב 37 ° C ו 5% CO 2 באוויר -95%.
- לאחר דגירה 1 שעה, supernatant יש להסיר ולהחליפו בינוני מיקרוסקופית טריים בתוספת ארגינין 0.4%.
- לדגור על 37 ° C ו 5% CO 2 באוויר -95% עבור נקודות זמן שונות (עד כ -8 שעות) ולנתח את שלמות monolayer CFBE באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב. אם תאים בדרכי הנשימה הם לא ומחוברות, פ aeruginosa יהיה מהיר (בתוך דקות), לקבל גישה אל פני השטח של התאים basolateral ולהרוס שלמות הסלולר. חיסון עם פ aeruginosa זנים constitutively להביע את התוצאות ב-GFP microcolonies biofilm פלורסנט אשר ניתן דמיינו ידי מיקרוסקופית epifluorescence או confocal.
- CFU חיידקים biofilm ניתן לקבוע על ידי שטיפת שיתוף תרבות 2-3 פעמים עם פוספט בופר סליין (PBS) לחסל חיידקים planktonic. בעקבות לשטוף, לטיפול עם 0.1% Triton X-100 ב-PBS או ממ במשך 10-15 דקות עד lyse בתאי אפיתל לפזר את biofilm.
- וורטקס במשך 3 דקות להכין דילולים הסידורי של lysate. פלייט אלה דילולים על אגר LB ו דגירה לילה בשעה 37 ° C. ספירת המושבות למחרת כדי לקבוע את CFU.
2. תא זרימה משותפת תרבות biofilm דגם
- תא זרימה משותפת תרבות biofilm Model (assay זרימה) כולל שינוי של מנגנון biofilm תקן תזרים התא כדי להתאים את התאים CFBE 5.
- מקום מספר 40 מ"מ זכוכית coverslips בקוטר לכוס של 100 מ"ל נקי. מכסים היטב עם 2 שכבות של נייר אלומיניום ו החיטוי על מחזור יבש עבור 20 דקות.
- עבודה במנדף תרבית תאים, לתפוס את אחד coverslip סטרילי מקנקן באמצעות מלקחיים אתנול שטף מקום לתוך צלחת פלסטיק סטרילי בקוטר 60 מ"מ.
- הוסף 3 מ"ל של מדיום מראש חימם צמיחת תאים, לחיצה על coverslip עם קצה פיפטה כדי להסיר כל בועה לכודה מתחת ו לכוח coverslip לתחתית צלחת הפלסטיק.
- 2x10 6 תאים זרעים לכל צלחת ולנער את המנה בעדינות קדימה ואחורה. הימנע מתערבל למנוע centrifuging התאים על צדי המנה.
- מניחים את צלחת ב CO 2 של 5% -95% אוויר החממה ב 37 ° C ו להאכיל את התאים בכל יום אחר עם צמיחה בינוני מ"ל 3 טרי במשך 8 עד 10 ימים. התאים יהוו monolayer ומחוברות על coverslip הזכוכית.
- לגדול פ aeruginosa ב LB 5 מ"ל במשך 18 שעות ב 37 ° C על שייקר אינקובטור ב 200 סל"ד. בתנאים אלה, פ תרבויות aeruginosa יהיו בדרך כלל להגיע צפיפות 5x10 9 CFU / ml. אנו משתמשים P. זן PAO1 aeruginosa נושאת את pSMC21 פלסמיד ביטוי המכונן של ה-GFP 6.
- הוסף 1 מ"ל של תרבית החיידקים לתוך צינור microcentrifuge סטרילית. צנטריפוגה בסל"ד 6000 3 דקות, ולשטוף את הכדור חיידקי פעמיים 1 מ"ל של מדיום מיקרוסקופית.
- מדולל 0.5 מ"ל של חיידקים שטף resuspended לתוך בינוני 4.5 מ"ל מיקרוסקופית כדי להשיג ריכוז של ~ 5x10 8 CFU / mL.
- תצפית של תאים חייםבזמן אמת דורש קאמרית הדמיה מצמידים את המשאבה peristaltic (כדי להבטיח זרימה של חומרים מזינים עבור המורחבת אורכים זמן) לבין בקר טמפרטורה. אנו משתמשים FCS2 Bioptechs (Focht Live-Cell) תא מחוברת משאבה תזרים נמוך מיקרו זלוף עם 1 / 16 C-Flex ה לחתוך צינורות מאמצים המתאימים autoclaved על סטריליות, טמפרטורה, מוסדר באמצעות הבקר קאמרית FCS2. אנחנו שומרים את מקור הקלט של המדיום אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים ממוקם ממש ליד המיקרוסקופ.
- להרכיב את התא זרימה. חדר FCS2 כולל בסיס עצמית נעילה (אשר יושב על מתאם את הבמה במהלך ההדמיה) ואת החלק העליון מחובר צינורות טפטוף ואת הבקר קאמרית. החדר מורכב הפוך לפני התהפך והניח על מתאם את הבמה. החזק את החלק העליון של החדר במהופך כך צינורות טפטוף גלויים, וליישר את החורים אישור של 0.75 מ"מ אטם גומי עבה אל צינורות טפטוף. סטאק את השקופית microaqueduct מסופק עם חדר על גבי אטם גומי, כדי לוודא שהצד מחורץ הוא למעלה, למקום אחר אטם גומי על גבי השקופית. עובי וגיאומטריה הפנימי של אטם השני יקבע את עוצמת הקול של האולם. אנחנו בדרך כלל עובדים עם אטם 0.75 מ"מ גומי עבה עם הגיאומטריה 30 מ"מ פנימי עגול.
- הוסף 1 מ"ל של טרום התחמם (37 ° C) בינוני מיקרוסקופית במרכז השקופית.
- אחזר מנה 60 מ"מ של תרבית תאים חממה, להסיר את המדיום בילה לשטוף את התאים פעם עם 3 מ"ל של מדיום מראש חימם מיקרוסקופית. צעד זה מבטיח את חיסול האדום ואנטיביוטיקה פנול הנוכחי במדיום צמיחת תאים. פנול אדום הוא פלורסנט קלה והוא יכול להפריע הדמיה, בעוד אנטיביוטיקה יכולה למגר פ aeruginosa החיידקים לפני שהם יכולים להקים biofilms.
- שימוש באתנול שטוף מלקחיים, לאחזר את coverslip מצלחת ולהפחית אותו הפוך על החרוזים של המדיום מיקרוסקופית למקם על החדר. Coverslip כעת מונחת על אטם הגומי השנייה monolayer של תאים האוויר כלפי מטה.
- החזקת רכיבים מורכבים ביד אחת, במקום בסיס של החדר על גבי מחסנית, ולהפוך את החדר במהירות על כך שהכל בצד ימין למעלה. נעל את בסיס למקום על ידי סיבוב טבעת.
- חברו את צינור כניסת לזרום נמוך המיקרו זלוף משאבה ולהתחיל את זרימת בשיעור של 20 מ"ל / שעה, זה קצב הזרימה בתוך יכולת השחייה המהירות של פ aeruginosa. חתיכת השני של קישורים בצינור המשאבה כדי בבקבוק של המדיום מיקרוסקופית למקם 37 ° C אמבט מים ממוקם ממש ליד המיקרוסקופ.
- צרף סטרילי מראש לחתוך 1 / 16 ה-C-Flex צינורות אל מפרצון ו זלוף צינורות המוצא של החדר, לחבר את בקר טמפרטורה, ואז למקם את חדר התאספו לבמה מיקרוסקופ של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה.
- באמצעות מזרק 1 מ"ל חד פעמיות, להזריק את ההשעיה חיידקי מוכן בעבר החדרה, באמצעות שסתום דו כיווני להציב קו בין המשאבה לבין קאמרית. בסביבה שלנו בפרט, זה לוקח נפח 0.6 מ"ל של השעיה חיידקי להגיע קאמרית. התאם את עוצמת הקול על פי אורך צינור הספציפית שלך. אנחנו גם למצוא את זה שימושי למקום in-line הפנויה 0.22 מיקרומטר לסנן בין המשאבה לבין שסתום דו סטרי כדי למנוע מחיידקים שחייה נגד הזרם ו לזהם את הבקבוק קלט.
- כדי לאפשר לחיידקים לצרף לתאי דרכי הנשימה, להפסיק את המשאבה על 2h. תזרים אז יכול להיות מוכנס שוב בסוד ומתוחזק על 20 מ"ל / שעה במשך כל הניסוי.
- צג על שלמות התאים דרכי הנשימה לעומת ההפרש התערבות (DIC) מיקרוסקופיה לאורך הניסוי כדי לבדוק סימנים של נזק monolayer. במקביל, לעקוב אחר התפתחות של ה-GFP שכותרתו פ aeruginosa biofilms על פני השטח של תאים apical דרכי הנשימה באמצעות רכישת תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך confocal או רחב בתחום.
3. נציג תוצאות
אנו משתמשים זן של פ aeruginosa המכיל את pSMC21 פלסמיד המאפשר ביטוי המכונן של ה-GFP 6. מסיבה זו, ה-GFP שכותרתו biofilms גוברת על monolayer CFBE ניתן דמיינו ידי מיקרוסקופית epifluorescence. לחלופין, להדמיה של biofilm ניתן להשיג על ידי פ 'מכתים ללא תווית aeruginosa עם פתרון 1% לבן calcofluor שעה 1 ב 37 ° C 1.
ליצירת biofilm הדמיה על תאים CFBE ב assay את זרימת, אנו משתמשים במתאם מחוייט הבמה, אך מספר חברות יכולים כעת לספק מתאמי הבמה מצויד במיוחד. אנו עובדים עם מיקרוסקופ אולימפוס IX70 הפוך מצויד במצלמה ORCA-AG עמוק CCD קירור X60 הנפט טבילה אובייקטיבי (הצמצם המספרי 1.40). המסנן wהעקב הוא מצויד במסנן 480/40 הלהקה ננומטר עירור לעבור ננומטר 535/30 הלהקה לעבור סינון פליטה. תמונות דיגיטליות נרכשו עם החבילה OpenLab 4.0.3 תוכנה (אימפרוביזציה) ו כרכים היו deconvolved ידי איטרטיבי שיקום באמצעות 3.5.1 Volocity תוכנה (אימפרוביזציה). ניתוח כמותי של מבנים biofilm 3D הושג עם חבילת תוכנה לניתוח סטטמ"מ תמונה 7,8.
לגבי מודל שיתוף כל תרבות נחשב, יש לשים לב במיוחד cytotoxicity המתפתח בין מרכיבי המודל. הן סטטיות התא מבחני זרימה, מצאנו כי monolayer CFBE יכלו לעמוד נוכחות של פ aeruginosa עד 8 שעות לאחר חיסון בלי שום סימן של שינוי. שלמות monolayer אפיתל ניתן להעריך על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד באמצעות מיקרוסקופ הפוכה 1 (איור 1 א) או על ידי התערבות מיקרוסקופיה ההפרש (DIC) לעומת זאת לאורך הניסוי 5. במשך הזמן, פ aeruginosa יהיה לייצר רעלים וגורמים ארסיות אשר מצטברים ויכולים לגרום נזק monolayer תא האפיתל במלואה או בחלקים (איור 1B-1C). Cytotoxicity ניתן להעריך כמותית באמצעות ערכות שונות למדוד את שחרורו של לקטט דהידרוגנז LDH () מתאי אפיתל. LDH הוא אנזים cytosolic יציב שוחרר הסביבה תאיים על תמוגה התא או מוות של תאים.
כאשר שלמות monolayer דרכי הנשימה לא נפגעת (בדרך כלל עבור חיסון ~ h 8 הבא), עמ ' biofilms aeruginosa מצליח ליצור ולפתח את פני השטח של תאים apical דרכי הנשימה הן שיתוף תרבות מודלים תיאר (איור 2A, 2B). בעקבות שחזור 3D (איור 2C) וכימות, הצטברות ביומסה ניתן לקבוע במדויק. השתמשנו גם אלה שיתוף תרבות biofilms מבחני פנוטיפי מספר. למשל, כפי שהוזכר לעיל, biofilm CFU ניתן לקבוע בקלות על ידי lysing בתאי האפיתל, סדרתי דילול lysate, וכן ציפוי על צלחות אגר. מצאנו טכניקה זו יתרון בקביעת ההתנגדות של זנים שונים לטיפול אנטיביוטי. יתר על כן, רעילות biofilm כלפי לתאי האפיתל ניתן למדוד באמצעות זמינים מסחרית ערכות זיהוי LDH. באופן זה, תפקידם של גורמים ארסיות על הרעילות של biofilms ניתן להעריך. מערכות אלו גם מודל תמיכה מספר יישומים ביטוי גנים, כולל פיוז'ן מחקרים האמרגן, RT-PCR, וניתוח microarray 1,5,9.
באיור 1. Monolayer של תאים CFBE ותמונות נציג נפגעת נפגע תא monolayers דרכי הנשימה עקב פ biofilm צמיחה aeruginosa. (א) התמונה נציג monolayer ומחוברות של תאים CFBE הגדלים בתרבית רקמה צלחות, שהוערכו על ידי מיקרוסקופ שלב ניגודיות. סרגל קנה מידה, 120 מיקרומטר. (ב) דוגמה בשכבה CFBE בסכנה. למרות monolayer אינו מוצג סימנים גלויים לעין נזק עדיין, פ חיידקים aeruginosa נראים להפיץ בין צמתים הדוקים של תאים אפיתל גישה צובר את הקרומים basolateral. היווצרות biofilm הוא בדרך כלל לא מושגת בתנאים אלה עקב monolayer המידרדר. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. (ג) דוגמה של פ מגודל biofilm aeruginosa נצפתה 24 שעות לאחר חיסון. לאחר בהצלחה לתמוך היווצרות biofilm, monolayer CFBE נפגע ללא תקנה וכעת הוא נעדר כמעט. Biofilm שיורית, גדל כשכבה שטוחה של חיידקים, מוצג הצמדת coverslip הזכוכית. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר.
איור 2. פ biofilms aeruginosa גדל על פני השטח של תאים apical CFBE ומחוברות באמצעות מודל סטטי שותף תרבות biofilm ואת התא זרימה משותפת תרבות דגם biofilm. (א) נציג תמונה של ה-GFP-לבטא פ biofilm aeruginosa גדל על monolayer ומחוברות של תאים CFBE באמצעות מודל סטטי שותף תרבות biofilm, מוערך על ידי מיקרוסקופיה epifluorescence. התמונה היא שכבת הערוץ בניגוד לשלב את ערוץ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה, 35 מיקרומטר. (ב) נציג תמונה של ה-GFP שכותרתו פ biofilm aeruginosa גדלה עבור h 6 על monolayer ומחוברות של תאים CFBE באמצעות תא זרימה משותפת תרבות דגם biofilm. כדי להקל על ויזואליזציה של monolayer את דרכי הנשימה, גרעינים הוכתמו 10 מיקרוגרם / מ"ל Hoechst 33,342 (בדיקות מולקולריות) למשך 30 דקות לפני חיסון עם פ aeruginosa. תמונות הממוזג pseudocolored נתפסו לעומת ההפרש התערבות (DIC), ואת התמונות פלורסנט המקביל מוצגות. Biofilms, הצגת כמו גושים ירוקים מחוברים אל פני השטח של תאים apical CFBE, מפוזרים על פני תאים בדרכי הנשימה. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. (ג) תלת ממדי reconstruction של Z-סדרת ערימות התמונה מראה את טיפוסי מבנים דמויי פטריה של פ בן 6 שעות biofilms aeruginosa להרכיב על monolayer תא CFBE. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biofilms הן הקהילות של חיידקים היוצרים בתגובה לגירויים סביבתיים. אלה אותות סביבתיים להוביל שינויים רגולטוריים הגלובלית בתוך כל חיידק, וכתוצאה מכך מחייב משטח, צבירה, ייצור exopolysaccharides ו פנוטיפים אחרים כגון עמידות לאנטיביוטיקה גדל 10. במהלך השנתיים האחרונות של עשרות שנים, הרבה הוכחות יש תמכו בהשערה כי biofilms לשחק תפקיד גדול בפתוגנזה של דלקות כרוניות. למשל, מקובל גם כי פ aeruginosa מסוגל להקים דלקות כרוניות של הריאות של סיסטיק פיברוזיס (CF) מטופלים על ידי יצירת biofilms 11. CF היא מחלה גנטית, שם מוטציות בגן CFTR להוביל הפרשת כלוריד פסולים 12. חולי CF בדרך כלל ניסיון לשנות דרכי הנשימה פיזיולוגיה המוביל תקעים הריר הסמיך בדרכי הנשימה, ובמקביל לזיהום מיקרוביאלי 13. עד גיל ההתבגרות מאוחר, הסוכן זיהומיות שולט של CF דרכי הנשימה היא P. aeruginosa, המוביל לדלקת כרונית biofilm כי הוא עמיד לאנטיביוטיקה 14.
פרוטוקולים המתוארים במאמר זה פותחו כדי לשמש מודל ללימוד מערכות היווצרות biofilm על לתאי ריאה חיים. Biofilms חיידקית הם מעורבים מדינות מחלות רבות, ובכל זאת, יש בעיקר נחקרו על אי - חיים משטחים מוצקים, כגון זכוכית ופלסטיק 15,16. על ידי לימוד היווצרות biofilm וגידול על משטחים אביוטי רק אחד חסר חשיבות האינטראקציות בין פתוגן לבין מארח זה יכול להתרחש רק עם מערכת מודל כזה כפי שמתואר בפרוטוקולים לעיל. באופן ספציפי, המודל הסטטי שותף תרבות biofilm ואת התא זרימה משותפת תרבות דגם biofilm לנצל את היכולת של פ aeruginosa לתקשר עם להיקשר אל פני השטח האפיתל של הריאות. באמצעות מודלים אלה, הראינו כי התגובה של שיתוף תרבות biofilms לטיפול אנטיביוטי היא ייחודית כי המודלים האלה נוטים לשקף במדויק את מצב זיהומיות 1,5. בהקשר זה, יש לנו דיווח כי התנגדות מגדילה tobramycin ידי> 25 כפולה כאשר פ biofilms aeruginosa מגדלים תאים על דרכי הנשימה בהשוואה biofilms גדל על משטחים אביוטי כגון זכוכית 5. סביר להניח כי טכניקות אלה משקפים את האירועים המתרחשים במהלך הקולוניזציה מוקדם של 17 הריאה. לכן, שיתוף התרבות מערכות מודל מייצגים כלים חדשניים להבנת זיהום מוקדם של אפיתל דרכי הנשימה CF על ידי פ aeruginosa 1.
תרבות מערכות רקמות יש בדרך כלל הועסק להבין אינטראקציות בין המארח הפתוגן. נקטנו האינטראקציות הללו צעד אחד קדימה על ידי יצירת biofilms על חיים אנושיים לתאי האפיתל. בעתיד, בגרסאות של הדגמים שתוארו כאן עלול לשמש כדי לחקור היווצרות biofilm של חיידקים שונים במדינות זיהומיות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ג O Toole הדרכה והצעות בפיתוח המודלים האלה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס (ANDERS06F0 כדי GGA, STANTO07RO ו STANTO08GA כדי BAS), המכונים הלאומיים לבריאות (T32A107363 כדי GGA ו-R01 HL074175 כדי BAS), לבין המרכז הלאומי למחקר משאבים מרכזי מצוינות למחקר ביו (COBRE P20-RR018787 כדי BAS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs | 060319131616 | |
| FCS2 chamber controller | Bioptechs | 060319-2-0303 | |
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs | PH 40-1313-0319 | |
| MEM | Mediatech, Inc. | #10-010-CV | |
| MEM without phenol red | Mediatech, Inc. | Mediatech, Manassass, VA |
References
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).
- Bruscia, E. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 9, 683-685 (2002).
- Cozens, A. L. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
- Hentchel-Franks, K. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).
- Moreau-Marquis, S. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, (2005).
- Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146 (Pt 10), 2409-2415 (2000).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A. The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system. Infect Immun. 78, (2010).
- Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).
- Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J Cyst Fibros. 4, Suppl 2. 49-54 (2005).
- Ko, Y. H., Pedersen, P. L. Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease. J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).
- Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).
- Furukawa, S., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- Gomez, M. I., Prince, A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis. Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).
