Summary
Мы продемонстрируем, как изучение влияния одной точечной мутации на функции ионных каналов.
Abstract
Мы продемонстрируем, как изучать функциональные последствия введения точечная мутация в ионного канала. Мы изучаем G белка закрытого внутренне исправления калия (именуемые GIRK) каналов, которые важны для регуляции возбудимости нейронов. Есть четыре различных млекопитающих GIRK канал субъединиц (GIRK1-GIRK4) - мы ориентируемся на GIRK2 потому что она образует homotetramer. Стимуляция различных типов G-белком рецепторы (GPCR), такие как мускариновых рецепторов (M2R), приводит к активации каналов GIRK. Алкоголь также непосредственно активирует GIRK каналов. Мы покажем, как мутировать одной аминокислоты на специально изменение одного или нескольких нуклеотидов в кДНК для канала GIRK. Это мутировавший кДНК будет усиливаться у бактерий, очищенная и наличие точечной мутации будет подтверждена путем секвенирования ДНК. КДНК для мутировал и дикого типа каналов GIRK будет трансфицировали в человеческих эмбриональных почек HEK293T клетки культивировали в пробирке. И наконец, целых клеток патч-зажим электрофизиологии будет использоваться для исследования макроскопических калия токов через эктопически выразил дикого типа или мутировавших каналов GIRK. В этом эксперименте мы исследуем влияние L257W мутации в GIRK2 каналов на M2R-зависимый и алкогольной зависимостью активации.
Protocol
1. Сайт направленного мутагенеза
Мы используем выражение млекопитающих плазмиды pcDNA3.1 кодирования кДНК GIRK2 и ввести точечная мутация использованием Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL II сайт-направленного мутагенеза комплект, в соответствии с инструкциями производителя.
Грунтовки последовательность может быть легко создан с помощью онлайн программы дизайна грунтовки по адресу:
https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15
Примечание: Мы используем стандартные Эппендорф 1,5 мл труб в месте BD 14 мл труб описаны в протоколе. Тем не менее, использование XL10-Gold ultracompetent Е. палочки, предварительно обработанных β-меркаптоэтанола, 30 тепла времени шок и NZY + (или NZYM +) средства массовой информации имеют решающее значение для успешного мутагенеза. Если это возможно, инженерных дополнительные молчать мутации, которая создает новый сайт ограничение может быть удобно для скрининга мутантов колонии ниже.
2. Miniprep, Секвенирование ДНК и Maxiprep
2,1 Qiagen miniprep и последовательности.
Индивидуальные бактериальных колоний собирают и выращивают в LB бульоне с ампициллином (AMP). Мы следуем инструкциям производителя для очистки кДНК. Простой переварить ограничения могут быть использованы подтверждения успешного внедрения мутации, если ограничение сайт включен в шаге 1 выше. Автоматизированная секвенирования ДНК осуществляется за пределы участка, и необходимо, чтобы подтвердить наличие мутации в кДНК, а также оценить, является ли Есть какой-либо нежелательных мутаций. Этот шаг очень важен. Мы последовательности всей GIRK кодирующей последовательности с использованием форвардных Т7 промотора и обратном BGH последовательности праймеров, которые фланге нескольких сайтов клонирования pcDNA3.1 плазмиды.
Примечание: Очень важно, чтобы внимательно осмотреть секвенирования electropherogram обеспечить достаточное качество последовательности данных. Высокое качество electropherogram имеет острые, не совпадающих вершин с небольшой фоновый шум.
2,2 Qiagen maxiprep.
Мы следуем инструкциям производителя.
Примечание: Этот шаг входит в наших экспериментах, для улучшения чистоты кДНК, которую мы находим очень важно для эффективной трансфекции.
3. Культура и Трансфекция HEK293T Клетки
Все эти шаги следует делать в стерильных капот культуры ткани.
3,1 клеточных культур
HEK293T клетки удобно пользоваться, потому что они просты в культуре (37 ° С, 5% СО 2 увлажненный инкубатор), имеют быстрое время репликации, высокая эффективность трансфекции и поддаются цельноклеточная патч-зажим электрофизиологии. HEK293T клетки экспрессируют SV40 большой антиген T, что обеспечивает эписомной репликации pcDNA3.1 плазмиды.
HEK293T клетки культивируют в странах с низким глюкозы DMEM среде с L-глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Для пассирования клеток, добавить 0,25% трипсин / ЭДТА конфлюентных (90-95%) клеток HEK293T, подождите, пока клетки отделяются от ткани блюдо, а затем остановить активность фермента путем добавления свежей среды, содержащей FBS /. Пластина ~ 1 X 10 5 клеток / лунку в 12 хорошо блюдо культуре клеток вместе с 1 мл антибиотика без питательной среды на лунку. (1 х 10 5 клеток составляет ~ 350 мкл клеточной суспензии, полученной из сливной T25 колбу ресуспендировали по 10 средств массовой информации мл).
3,2 Трансфекция
После 8-24 часов, НЕК клетки будут придерживаться пластика и готовы для трансфекции. Трансфекции клеток с 0,2 мкг канал кДНК, 0,4 мкг M2R рецептор кДНК и 0,04 мкг YFP кДНК использованием Invitrogen Lipofectamine 2000 года. Обратите внимание: мы используем небольшое количество YFP кДНК чтобы определить, какие клетки успешной трансфекции (зеленые клетки, вероятно, содержат как GIRK каналов и М2 рецепторы). Концентрация кДНК использовать, будет нуждаться в корректировке для каждого клона.
3,3 флуоресценции визуализации трансфекции клеток.
Место 12-луночного планшета на сцене перевернутой флуоресцентного микроскопа, и исследовать клетки для YFP выражения. По сравнению с DIC изображение и обратите внимание на приблизительное количество зеленых клеток. Это дает оценку эффективности трансфекции.
3,4 Подготовка 24-а блюда и поли-D-лизин покрытием скользит крышка
Чистый 12 мм стеклянная крышка скользит (Warner, CS-12R), встряхивая их в течение ночи с Radiacwash, с последующей промывкой деионизированной воды и ночь дрожит в 95% этанола. Магазин чистой скользит покрова в 70% этанолом до использования.
Место крышка сползает в чашку Петри с этанолом, пламя от этанола использованием щипцов и горелки,е место в одну лунку стерильного 24-луночный планшет.
Обложка каждую лунку по 250 мкл поли-D-лизина (PDL) решения [0,2 мг / мл], а крышка скользит на ночь погруженный в решение PDL в стерильных капотом. Оберните 24-луночный планшет в парафильмом, чтобы избежать испарения.
На следующее утро, аспирация PDL и мыть 2 раза стерильной водой. Оставьте пластины открыты для сухой под капот, затем накройте. 24 и блюда с покрытием скользит крышка может быть обернуты в стерильной алюминиевой фольги и хранить при комнатной температуре в течение недели.
3,5 Покрытие трансфицированных клеток HEK293T на обложке квитанции
24 часа после трансфекции, разделение клеток в 24-луночных блюдо (~ 4 х 10 3 клеток / лунку), содержащий стеклянная крышка скользит покрытые поли-D-лизина. Примечание: трансфекции клетки могут быть использованы в течение 24-72 часов после трансфекции. Клетки делятся, чтобы обеспечить индивидуальный скользит крышка для патча эксперимент зажим электрофизиологии.
4. Электрофизиология
4.1 Подготовка решений
Внеклеточной (ванна) решение: 20 мМ KCl, 140 мМ NaCl, 0,5 мМ CaCl 2, 2 мМ MgCl 2 и 10 мМ HEPES (рН 7,4 комплекте с NaOH).
Алиготе 20K решение ванну и добавить соответствующие модуляторы
- 20К + Ba 2 +: раствор, содержащий 1 мМ BaCl 2: специфический ингибитор внутреннее исправление токов
- 20К + карбахола: решение с 5 мкМ карбахола: специфическим агонистом M2R; M2R пары G-белков, которые открывают каналы GIRK
- 20К + Этанол: ванна раствора, содержащего 100 мМ этанола для активации GIRK каналы непосредственно
Место решения в ванной шприцы (решение контейнеров) из системы быстрого обмена перфузии. Примечание: Мы используем клапан Warner щепотку система контроля ванны решений. ПЭ трубы рекомендуется.
Внутренняя / электрод решение: 140 мМ KCl, 20 мМ NaCl, 5 мМ EGTA, 5,4 мМ MgCl 2, 10 мМ HEPES (рН 7,4) с 2,5 мМ K 2 АТФ и 0,3 мкМ Li 2 ГТФ.
Мы делаем электрода решение без АТФ и ГТФ. Мы отдельно подготовить порции АТФ и ГТФ, которые хранятся при температуре -80 ° С, и добавить к электроду решение на день эксперимента. Мы продолжаем шприц с окончательным решением электрода на лед, чтобы сохранить ATP / GTP. Мы стерильный фильтр (0,2 мкм) внутренних / внешних решений для подавления роста микроорганизмов и снизить возможность засорения труб и электродов.
4,2 Тяговое электродов
Мы используем Narishige двухступенчатый вертикальный съемник и боросиликатного стеклянного электрода с Warner Инструмент (1,5 мм наружный диаметр, 0,86 мм и внутренним диаметром 7,5 см длиной), чтобы получить электроды с 3-7 МОм сопротивления при заполнении внутриклеточных решение.
Примечание: Необходимо экспериментально определить параметры съемник электрода и типа электрода стекла в вашей лаборатории. Для нашей вертикальной съемник, мы используем тепло установка 60,2 за первый тянуть и ~ 43 для второй тянуть.
4,3 Цельноклеточная патч зажима
- Горы покровным стеклом в 35 мм блюдо использованием небольшого количества вазелина, крышка с внешним раствором и поместите блюдо на стадии перевернутой флуоресцентного микроскопа. Используйте DIC, чтобы сосредоточиться и найти ячейки, переключиться на YFP флуоресценции, чтобы найти YFP положительных клеток.
- Позиция кончика перфузии коллектор возле зеленую клетку (20-30 мкм от ячейки интерес = 2-3 длина ячейки друг от друга).
- Заполните электродов с раствором, приложить его к headstage усилителя Axopatch 200B (Axon Instruments) со следующими начальными параметрами: Gain 1, Конфигурация: цельноклеточная β = 1, режим V-зажимом.
- Применение положительного давления на электрод, чтобы предотвратить засорение пипетки, и использовать манипулятор разместить электрод прямо над ячейкой.
- Для нулевой потенциал пипетки, выберите кнопку Печать Тест, чтобы доставить шаг испытательного напряжения. 5 мВ прямоугольной ступеньки напряжения появится в окне Печать испытание CLAMPEX. Отрегулируйте Внесите Смещение потенциометра на усилитель принести базовой линии тока 0 нА. Кроме того, нулевой потенциал пипетки путем переключения режимов усилителя с V-трек режиме и метр ручку Vtrack и использовать пипетки Смещение потенциометра на усилитель для приведения напряжения на дисплее усилителя метр "0.00".
- Проверьте сопротивление электрода использованием печать тест командованием CLAMPEX 8,2 программного обеспечения (должно быть 3-7 МОм).
- Открытие сохраненной протокол файла или создать новый протокол. Чтобы открыть файл протокола выберите из главного меню затем приобретает открытый протокол и выбрать сохраненный файл напряжения протокола. Для этого эксперимента, протокол был создан для проведения мембранного потенциала на 40 мВ-, доставки одного 50 мс напряжение шаг до -100 мВ и рампы до +40 мВ более 200 мс. Этот протокол выполняется каждые 2 секунды. Рампы протокол позволяет для наблюдения потенциал реверсии и внутрь исправление каналов GIRK. Для напряжения закрытого ионных каналов, прямоугольной ступеньки напряжения может быть более подходящим.
- Подход ячейку с помощью тонкой настройки манипулятора, релиз положительного давления, после прикосновения к поверхности клетки применяют отрицательное давление, и контролировать увеличение сопротивления в окно осциллографа испытаний Seal. Как только сопротивление находится в диапазоне ГОм, электрод имеет герметичный на мембране (Gigaseal сформировалась).
- Применить импульса отрицательного давления разорвать клеточную мембрану и получить доступ в клетку. После того как в цельноклеточной конфигурации, вы будете регистрироваться увеличился емкостных токов.
- Переключить на мембранные тест в CLAMPEX и запишите доступ сопротивления RA, RM сопротивление мембраны, Ст мембраны емкость и проверить на глаз экспоненциальной подгонки теоретической кривой к реальному емкостного тока. Мембранные емкость пропорциональна размеру ячейки и будет использоваться в дальнейшем для вычисления плотности тока.
- Переключитесь на печать испытаний, установить V-Out (мембранный потенциал) до -40 мВ и фильтр на частоте 10 кГц
- Компенсировать емкость мембраны и последовательное сопротивление на усилителе с помощью следующих шагов:
- Коммутатор ВЕСЬ переключатель CAP ячейку. Отрегулируйте ВЕСЬ CAP CELL и набирает последовательное сопротивление взад и вперед, пока вы не получите плоский импульс тест. Вам также может понадобиться для настройки пипетки емкостью БЫСТРО ручку CAP.
- Включите% ручку ПРОГНОЗ около 60-80%, опять же Переустановка ВЕСЬ CAP CELL и набрать последовательное сопротивление (возможно, вам придется скорректировать пипетки емкостью компенсации БЫСТРО CAP ручку, а).
- Включите% COMP-до 100% без осциллирующих клетки, пытаясь сохранить импульс квартире Переустановка ВЕСЬ CAP CELL и последовательное сопротивление (возможно, вам придется скорректировать пипетки емкостью компенсации БЫСТРО ручку CAP, а). Отрегулируйте отставание за счет уменьшения постоянной времени.
- Запишите значения для Ст (мембраны емкость), R (последовательное сопротивление),% COMP,% PRED и Лаг времени, установленного на усилителе в блокноте. Ст и РТС должна быть примерно такой же, как Ст и Rm измеряется в Мембранные испытаний выше.
- Включите внешний клапан решение по контролю ванны решение. Установите усилитель 8-полюсный фильтр Бесселя к 2 кГц, открытый протокол напряжения зажим и начать запись токов.
- Мы записываем GIRK токов использованием рампы протокол, который шагов до -100 мВ в течение 50 мс, то рампы от 100 мВ до +40 мВ более 200 мс и подается каждые 2 секунды. Рампы протокол позволяет для наблюдения потенциал реверсии и для внутреннего собственности исправление каналов GIRK. При комнатной температуре (22-25 ° С), GIRK ток должен обратном около -50 мВ (20 мМ KCl в ванной), который находится вблизи рассчитывается равновесный потенциал для К (Е K = -50 мВ), то остаются довольно плоским в потенциалов положительного на E K.
- Экспериментальный Протокол: После записи стабильной базовой, переключиться на решение 20К + карбахола и ждать пика ответа, вернуться к 20K ванны решение, то применяются 20К + этанол и ждать максимальную чувствительность, затем переключитесь на 20K ванны решение, и, наконец, 20К + Ba 2 + решение. При применении этих препаратов Вы увидите изменения в амплитуде GIRK токов (наиболее выражен при -100 мВ). Обратите внимание на следы число, соответствующее применение различных внеклеточных решения в ноутбуке. Один файл Clampfit будет содержать все зачисток в течение всего эксперимента.
5. Анализ данных
Мы используем Clampfit 9,2 программное обеспечение для анализа данных GIRK токов при -100 мВ.
- Откройте файл с записью, установите курсор при -100 мВ. По умолчанию вы увидите все следы, наложенные на экране. Нажимая кнопку "Создать курсоры" значок, который вы создадите Excel-подобный таблицу с числовыми данными.
- Назначая X в колонке следа количество и Y, чтобы курсор столбца и нажав кнопку "Создать график" иконку можно быстро нарисовать время курса участок эксперимента.
- Рассчитать базальной текущей путем вычитания тока в присутствии Ba 2 + с текущих записаны во внешнем решении перфузии в одиночку ("20K текущий" минус "20K + Ba 2 + ток"). Рассчитать индуцированных токов путем вычитания тока в базальных 20K от токов активирован ("20K + карбахола текущий" минус "20K текущий", "20K + Этанол текущий" минус "20K ток"). Рассчитать плотность тока (пА / пФ) путем деления тока мембраны емкость (читать прямо с усилителем). Рассчитать процент активации путем деления индуцированных токов базальной токов и умножения на 100.
6. Представитель Результаты
Вы должны иметь возможность для записи ток от клеток, трансфицированных дикого типа каналов. Для измерения каналов GIRKд в внеклеточного раствора, содержащего 20 мМ K + (и 145 мМ K + внутриклеточные) они должны обладать сильным внутренним ректификации и разворот потенциал ~ -50 мВ, что является существенным свойством калиевых каналов. Дикого типа ток будет сильно возрастать на карбахола применение (3-5 раза больше, чем в базальных тока) и реагировать так же, 100 мМ этанола. Примечание: знак конвенции электрофизиологии является то, что внутренний ток отрицательных и внешний ток положителен. Для L257W мутации в спирте связывающего кармана GIRK2, вы увидите, ослабленный ответ на оба карбахола и этанола. Это говорит о том, что L257 участвует в спирте и г белка активации GIRK2 каналов. Для дальнейших примеров результатов GIRK2 мутагенеза, увидеть недавние публикации Aryal и соавт. 1.
Рисунок 1. Окно Clampfit 8,0 файле приведены данные для дикого типа GIRK2 записи. Верхняя левая панель показывает, наложенных зачисток записан в ответ на протокол рампы напряжения при наличии различных внешних ба решений. Курсор 1 позиционируется при -100 мВ. Курсор значения записываются в таблицу (правая панель). Нижняя левая панель показывает участок номер развертки против, тока. Обратите внимание на увеличение тока (сверху вниз отклонение) с этанолом (EtOH) и карбахола (карбонат) и текущей торможения с Ba 2 +.
Рисунок 2. Окно Clampfit 8,0 показывает, файл данных для мутанта GIRK2-L257W записи. Описания же, как на рисунке 1. Обратите внимание, потеря карбахола (карбонат), активации и снижение EtOH-индуцированных токов в мутанта каналов.
Discussion
Сайт-направленный мутагенез классического подхода к изучению структурно-функциональных отношений ионных каналов. Она основана на предпосылке, что путем изменения критических остатков один ионный канал должен иметь возможность наблюдать выраженные изменения в канале функции. Напротив, многие мутации в некритических положение может быть введено без серьезных осложнений для канала функции. Как правило, остаток в вопросе сначала мутировали в аланин, небольшая неполярная аминокислота, после мутации триптофан, крупнейшим из аминокислот 2. Если остаток имеет важное значение для канала функции, как мутации будут изменения активности канала. Если менее существенные остатки мутирует, последствия мутации, особенно аланина, часто ничем не примечательный. Триптофан мутации имеют больше шансов вызвать изменения из-за стерических препятствий связанных с размером триптофан. Часто, когда структурная информация отсутствует, систематическое мутации аланина или триптофана в пределах фрагмента канала (так называемый аланин или триптофан сканирования) могут быть использованы для обнаружения критических остатков. Важно отметить, что несколько клонов с разными точечных мутаций может быть подготовлен параллельно позволяет тестирования нескольких остатков в течение относительно короткого времени. В последнее время несколько кристаллических структур из каналов стали доступны 3,4,5. Они могут быть использованы предложить потенциальные ключевые остатки должны быть протестированы с использованием подхода, описанного в этом протоколе.
Измерения на дикого типа канала должна всегда сопровождать измерения мутант канал в качестве положительного контроля для обеспечения того, трансфекции и электрофизиологические эксперименты были проведены правильно. Точечные мутации могут привести к недостаточной функциональной ток, текущий похож на дикого типа или изменена регуляция активности канала. Отсутствие измеряемый ток может быть из-за неправильного складывания или изменены людьми. В таком случае это может быть полезно узнать, является ли канал трафика правильно поверхности с помощью анализа биотинилирование или иммунофлюоресценции окрашивание против внеклеточного теги (без ячейки пермеабилизации) различать нефункциональные каналы плазматической мембраны и каналы сохранены внутри клетки . Наконец, желательно, чтобы исследовать не только базальной активности канала, но и последствия мутации на канал регулирования. Различные механизмы модуляции канала функции могут быть изучены в зависимости от ионного канала интерес в том числе регулирование белков G, PIP2, ионов, концентрации АТФ, фосфорилирование (с использованием тирозин, серин или треонин мутация), убиквитинирования или sumoylation (с использованием лизина мутация) и прямого открывания канала или блокаторы.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Наша работа стала возможной благодаря финансовой поддержке фонда Мак-Найт Фонд Neuroscience (ССА), Национального института по злоупотреблению наркотиками (R01 DA019022; PAS) и предварительно докторскую NIH НРСА стипендии PA (F31AA017042) из Национального института злоупотребления алкоголем и алкоголизма. GIRK2-L257W мутант была предоставлена доктором Prafulla Aryal.
Флуоресцентный микроскоп и спонсорство любезно предоставлены инструменты Leica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | Sigma | Varies | |
| Mini Prep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Radiacwash | Biodex | 005-100 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | BD Biosciences | CB40210 | Poly-L-lysine can also be used |
| Maxi Prep Kit | Qiagen | 12263 | |
| QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit | Stratagene | 200512-5 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Cover slips ˆ… 12 mm | Warner Instruments | CS-12R | |
| Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall | Warner Instruments | G150-3 | |
| Inverted fluorescence microscope |  Leica |
DMI3000 B | |
| Electrophysiology | Nikon/ Leica/ Zeiss |
Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence |
|
| Amplifier | Molecular Devices | Axon Axopatch 200B amplifier | |
| Perfusion system | Warner Instruments | VC-6 Perfusion MM-6 | |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1320 digitizer | |
| Manipulators | Sutter Instruments | Manipulator: MP-85 | |
| Electrode Puller | Narishige | PC10 vertical electrode puller | |
| Isolation Table | Technical Manufacturing Corporation | Air table |
References
- Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation. Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).
- Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis. J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).
- Doyle, D. A., Cabral, M. orais, Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &, B. T., MacKinnon, R. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science. 280, 69-77 (1998).
- Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera. EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).
- Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 Å resolution. Science. 326, 1668-1674 (2009).
