異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

Summary

我々は、イオンチャンネルの機能上の単一の点変異の効果を研究する方法を説明します。

Abstract

我々は、イオンチャネルの点突然変異を導入することの機能的効果を研究する方法を説明します。我々は、ニューロンの興奮性を調節するための重要なGタンパク質依存性内向き整流カリウム（GIRKと呼ばれる）チャンネルを、研究しています。つの異なる哺乳類のGIRKチャネルのサブユニット（GIRK1 - GIRK4）があります - それはホモ四量体を形成するので、我々はGIRK2に焦点を当てる。このようなムスカリン性受容体（M2R）のようなGタンパク質共役受容体（GPCR）、、のさまざまな種類の刺激は、GIRKチャネルの活性化につながる。アルコールはまた、直接GIRKチャネルをアクティブにします。我々は、特にGIRKチャネルのcDNAで1つ以上のヌクレオチドを​​変更することにより、一つのアミノ酸を変異させる方法を紹介します。この変異cDNA配列は、精製された、細菌中で増幅され、点突然変異の存在はDNAシークエンシングによって確認されます。変異と野生型GIRKチャネルのcDNAは、in vitroで培養したヒト胚性腎HEK293T細胞にトランスフェクトされます。最後に、ホールセルパッチクランプ電気生理学は、異所性に発現した野生型または変異GIRKチャネルを介して巨視的なカリウム電流を研究するために使用されます。この実験では、M2R依存とアルコール依存性活性化に関するGIRK2チャンネルでL257Wの突然変異の効果を検討する。

Protocol

1。サイトには、突然変異誘発を監督

我々はGIRK2ために哺乳動物発現プラスミドpcDNA3.1コードするcDNAを使用し、製造業者の指示に従って、ストラタジーン（アジレントテクノロジー）Quikchange XL IIの部位特異的突然変異誘発キットを用いて点突然変異を導入する。

プライマーのシーケンスを簡単にオンラインで入手可能のプライマー設計プログラムを使用して生成することができます。
https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15

注：我々は、プロトコルで説明されているBD 14mlのチューブの代わりに標準のエッペンドルフ1.5 mlチューブを使用。しかし、XL10 - Goldをultracompetent E.の使用β-メルカプトエタノール、30代、熱ショック時とNZYを^+（またはNZYM ^+）メディアで前処理した大腸菌は、成功した突然変異誘発のための非常に重要です。可能であれば、新たな制限部位を生成する追加のサイレント突然変異をエンジニアリングする以下の変異体コロニーをスクリーニングするための便利です。

2。ミニプレップ、DNAシーケンシングとMaxiprep

2.1キアゲンミニプレップおよびシークエンシング。

個々の細菌コロニーをピックアップし、アンピシリン（AMP）を含むLB培養液で栽培されています。我々は、cDNAを精製するため、製造元の指示に従ってください。制限部位が、上記のステップ1で組み込まれている場合、単純な制限のダイジェストは、変異の導入に成功を確認するために使用することができます。自動化されたDNA塩基配列決定は、オフサイト行って、とcDNAの変異の存在を確認するために不可欠であるだけでなく、不要な変異があるかどうかを評価する。この手順は非常に重要です。我々は、シーケンス前方にT7プロモーターを使用して全体GIRKコーディング配列をし、pcDNA3.1プラスミドの側面に複数のクローニング部位ことBGH配列決定用プライマーを逆に。

注：配列データの十分な品質を確保するための順序エレクトロを慎重に検査することが重要です。高品質の電気泳動図では、少しバックグラウンドノイズとシャープ、非重複ピークを持っています。

2.2 Qiagen社maxiprep。

我々はメーカーの指示に従ってください。

注：この手順は、我々は効率的なトランスフェクションのために重要である見つけるcDNAの純度を、改善するために我々の実験に含まれています。

3。 HEK293T細胞の培養およびトランスフェクション

これらの手順はすべて、無菌組織培養フード内で行ってください。

3.1細胞培養

HEK293T細胞は、（37℃、5％CO _2の加湿インキュベーター）文化に容易であるため、使用すると便利です高速レプリケーションの時間、高いトランスフェクション効率を持ち、全細胞パッチクランプ電気生理学に適している。 HEK293T細胞はプラスミドpcDNA3.1のエピソーム複製を確実にSV40ラージT抗原を発現する。

HEK293T細胞は、L -グルタミンおよび10％ウシ胎児血清（FBS）を添加低グルコースDMEM培地中で培養されています。継代細胞の場合、細胞は/ FBSを含む新鮮な培地を添加することによって酵素活性を停止し、組織の皿からデタッチされるまで待って、トリプシン/ EDTAコンフルエント（90〜95％）HEK293T細胞に0.25％を加算します。プレート〜1 × 10 ⁵細胞/ウェル一緒にウェルあたり抗生物質フリーの培地1mlで12ウェル細胞培養用ディッシュに。 （1 X 10 ⁵細胞を10 mLの培地で再懸コンフルエントT25フラスコから得られた細胞懸濁液の〜350μLです）。

3.2トランスフェクション

8月24日時間後、HEK細胞は、プラスチックに付着するとトランスフェクションのために準備が整いました。 cDNAを0.2μgのチャネル、Invitrogen社リポフェクトアミン2000を用いてcDNAを0.4μgのM2R受容体cDNA及び0.04μgのYFPとトランスフェ細胞。注：我々は細胞が正常（緑色の細胞はおそらくGIRKチャネルとM2受容体の両方を含む）にトランスフェクトされているかを判断するためにcDNAのYFPの少量を使用する。使用するcDNAの濃度は、各クローンのために調整する必要があります。

トランスフェクション細胞の3.3蛍光可視化。

場所は、12ウェル倒立蛍光顕微鏡のステージ上にプレートし、YFPの発現のための細胞を調べます。 DIC画像と比較すると緑のセルのおおよその数をメモしておきます。これは、トランスフェクション効率の推定値を提供します。

24ウェルディッシュとポリ- D -リジンコートしたカバースリップ3.4準備

脱イオン水で洗浄し、一晩95％エタノールで振とうし、次いで、Radiacwashで一晩、それらを揺することによって12mmのガラス製カバースリップ（ワーナー、CS - 12R）を清掃してください。使用するまで70％エタノールできれいなカバースリップを保管してください。

、エタノールオフ炎は、鉗子とバーナーを使用して、エタノールとのペトリ皿にカバースリップを置き、滅菌24ウェルプレートの1つのウェルにDの場所。

ポリ- D -リジンの250μL（PDL）溶液で各ウェルをカバー[0.2 mg / mLの]とカバーガラスは一晩滅菌フードの下でPDLの溶液に浸漬放置します。蒸発を避けるために、パラフィルムで24ウェルプレートをラップします。

翌朝、PDLを吸引し、滅菌水で2倍を洗う。プレートをカバーし、フードの下で乾燥するために開いたままにしておきます。コー​​ティングされたカバースリップした24ウェルディッシュは無菌アルミ箔とで包み、数週間、室温で保存することができます。

カバースリップ上の3.5めっきトランスフェクトしたHEK293T細胞

ポリ- D -リジンでコーティングしたガラスカバースリップを含む24ウェルディッシュ（X 10 ³細胞/ウェル〜4）にトランスフェクション、分割セルの後に24時間。注：トランスフェクションされた細胞は、24から72時間後にトランスフェクションまで使用することができます。細胞は、パッチクランプ電気生理学的実験のために個々のカバーガラスを提供するために分割されています。

4。電気生理学

4.1準備ソリューション

細胞外（浴）溶液：20mMのKClを、140mMのNaCl、0.5mMのCaCl _2を 、2mMのMgCl ₂および10mM HEPES（NaOHでpH7.4のセット）。

注し20K浴溶液と適切な変調器を追加

• 20K +のBa ^{2 +：1mM}のBaCl _2を含む溶液：内向き整流電流の特異的阻害剤
• 20K +カルバコール：5μMカルバコールによる解決策：特定のM2Rのアゴニスト、オープンGIRKチャネルは、G -タンパク質にM2Rのカップル
• 20K +エタノール：直接GIRKチャネルをアクティブにするには100mMのエタノールを含む浴溶液

場所のバスのソリューション迅速な交換の灌流システムのシリンジ（溶液の容器）に。注：私たちはバスのソリューションを制御するために、ワーナーのピンチバルブシステムを使用する。 PEチューブをお勧めします。

内部/電極液：140 mMの塩化カリウム、20mMの塩化ナトリウム、5mMのEGTA、5.4 mMのMgCl _2、2.5mMのK ₂ ATPと0.3μMのLi ₂ GTP 10 mMのHEPES（pH7.4）に。

我々は、ATPとGTPなく電極のソリューションとなります。我々は別々に-80℃で保存されているATPとGTPのアリコートを、準備、そして実験の日に電極のソリューションに追加します。我々は、ATP / GTPを維持するために氷の上で最終的な電極の溶液をシリンジを保持します。我々は無菌フィルター（0.2μm）の内部/外部のソリューションは、微生物の増殖を阻害し、チューブと電極の目詰まりの可能性を低減するために。

4.2ポーリング電極

我々は細胞内液で満たされた抵抗のMΩ3月7日に電極を得るためにナリシゲ二段階垂直プラーとワーナー音源（1.5ミリメートル外径0.86内径7.5 cmの長さ）からホウケイ酸ガラス電極を使用してください。

注：これは実験的に研究室の電極プラーと電極のガラスの種類のパラメータを決定することが必要です。私たちの縦引き手のために、我々は2番目のプルダウンのための最初のプルと〜43に60.2の熱設定を使用します。

クランプ4.3ホールセルパッチ

1. ワセリンの少量を使用して、35mmディッシュ、倒立蛍光顕微鏡のステージ上で外部のソリューションと位置皿とカバーのスリップをカバーマウントします。細胞を集中し、見つけるためにDICに使用、YFP陽性細胞を見つけるために蛍光YFPに切り替えます。
2. 緑のセルの近くに血のマニホールド（離れて関心のセル20から30ミクロン= 2-3セルの長さ）の位置の先端。
3. ゲイン1、構成：：細胞全体のβ= 1、モードV -クランプ溶液と電極を埋め、以下の初期設定でAxopatch 200Bアンプのヘッドステージ（アクソンインスツルメンツ）に取り付けます。
4. ピペットの目詰まりを防ぐ、とだけセルの上に電極チップを配置するためにマニピュレータを使用して電極上に正圧を適用します。
5. ピペットの可能性をゼロに、試験電圧のステップを提供するためにシールのテストボタンを選択します。 5 mVの矩形の電圧ステップはClampexのシールのテストウィンドウに表示されます。 0 NAへの現在のベースラインを持って来るために、アンプにピペットオフセットポテンショメータを調整します。また、"0.00"へのアンプのメーターディ​​スプレイに電圧を実現するアンプのピペットオフセットポテンショメータをVTRACKして使用するV -トラックモードとメーターノブにアンプのモードセレクタを切り替えることにより、ピペットの可能性をゼロに。
6. Clampex 8.2ソフトウェア（MΩ3月7日になるはず）のシールのtestコマンドを使用して、電極の抵抗を確認してください。
7. 保存されたプロトコルのファイルを開くか、新しいプロトコルを作成します。メインメニューから選択したプロトコルのファイルを開くには[開く]プロトコルを取得し、保存されている電圧のプロトコルのファイルを選択してください。この実験では、プロトコルは、2以上40 mVに-100 mVとランプに、単一の50 msの電圧ステップを実現する、- 40mVの時の膜電位を保持するために作成されています00ミリ秒。このプロトコルは、2秒ごとに実行されます。ランプのプロトコルは、逆転電位の観察とGIRKチャネルの内向き整流することができます。電位依存性イオンチャネルの場合は、矩形の電圧ステップがより適切かもしれない。
8. マニピュレータの微調整を使用して、アプローチの細胞は、細胞表面は負圧を適用し、シールテストオシロスコープウィンドウで抵抗の増加を監視触れるした後、正圧を離します。抵抗は、GΩの範囲になると、電極は（Gigasealが形成されている）膜上に密封しています。
9. 細胞膜を破壊し、細胞内へのアクセスを得るために負圧のパルスを適用する。かつて全細胞構成では、増加した容量性電流を登録します。
10. Clampexの膜試験に切り替え、アクセス抵抗Ra、膜抵抗Rmを書き留めて、膜容量Cmと目で実際の容量性電流の理論曲線の指数関数フィットを確認してください。膜の静電容量は、セルサイズに比例し、電流密度を計算するために後で使用されます。
11. 10 kHzで-40 mVとフィルタへのテスト、設定されたV - OUT（膜電位）を密封するためにスイッチバック
12. 以下の手順にしたがって、アンプに膜の静電容量と直列抵抗を補償する。
    1. 上の全細胞CAPのスイッチを切り替えます。あなたが平らなテストパルスを取得するまで、前後に全細胞CAPと直列抵抗のダイヤルを調整します。また、ピペット容量FAST CAPのノブを調整する必要があります。
    2. 再び（あなたが同様にピペット容量補正FAST CAPのノブを調整する必要があるかもしれません）細胞全体のCAPと直列抵抗のダイヤルを再調整し、60〜80％の％予測ノブをオンにします。
    3. （あなたが同様にピペット容量補正FAST CAPのノブを調整する必要があるかもしれません）を再調整の全細胞CAPと直列抵抗でパルスがフラットに保つしようとしている間に、細胞を発振することなく％のCOMP -〜100％をオンにします。時定数を削減することで遅れを調整します。
    4. CMの値を書き留めて（膜の静電容量）、RS（直列抵抗）、％COMP、％はpredと遅延時間は、ノートブックで、アンプに設定。 CmとRsは、上記膜のテストで測定されたCmとRmのとほぼ同じにする必要があります。
13. 浴溶液を制御するために外部のソリューションのバルブをオンにします。 2kHzのアンプ8極ベッセルフィルタを設定し、電圧クランプのプロトコルを開いて、記録電流を始める。
14. 我々は、100 mVから200ミリ以上の+40 mVへの50ミリ秒後、ランプのために-100 mVの手順と2秒毎に配信されるランプのプロトコルを使用してGIRK電流を記録する。ランプのプロトコルは、逆転電位の観察のためにとGIRKチャネルの内向き整流のプロパティのできます。室温（22〜25 ° C）、現在はKのための計算された平衡電位_（E、K = -50 mVの）に近い-50 mVの（バスで20 mMのKClを持つ）、近くに逆転してくださいGIRKで、その後、残るE _Kに正の電位でかなりフラット。
15. 実験プロトコール：安定したベースラインを記録した後、ソリューション20Kに+カルバコールを切り替えてから20K +エタノールを適用し、ピーク時の応答を待つ、そして20K​​浴溶液に切り替え、そして最終的にするために、20K浴溶液に切り替える、応答のピークを待つ20K +のBa ^{2 +}ソリューション。これらの薬剤の適用中に、GIRK電流（-100 mVで最も顕著）の振幅の変化が表示されます。ノートブック内の異なる細胞外ソリューションのアプリケーションに対応するトレース番号に注意してください。シングルClampfitファイルには、全体の実験のためのスイープのすべてが含まれます。

5。データ解析

我々は-100 mVでデータGIRK電流を分析するためにClampfit 9.2ソフトウェアを使用してください。

1. 録音したファイルを開いて、-100 mVでカーソルを設定します。デフォルトでは画面上にオーバーレイすべてのトレースが表示されます。 "カーソルを書く"アイコンを押すと、数値データをExcelのようなスプレッドシートを作成します。
2. 割り当てXによるトレース番号の列とカーソルの列にYにして、迅速に実験のタイムコースプロットを描くことができる"グラフを作成"アイコンを押す。
3. ⁺単独で外部灌流液（"20K現在の"マイナス"20K +のBa ^{2 +}現在"）に記録された電流からのBa ²の存在下で現在の引くことにより基底電流を計算します。活性化電流から20Kで基底電流を減算することにより誘導電流を計算する（"20K +カルバコール現在の"マイナス"20K現在の";"20K +エタノール現在の"マイナス"20K現在"）。膜の静電容量（アンプから直接読み込む）ことによって電流を除算して電流密度（PA / pF）を計算する。基底電流による誘導電流を割り100倍することによって、パーセントの活性化を計算する。

6。代表的な結果

あなたは野生型チャネルをトランスフェクトした細胞からの電流を記録することができるはずです。 GIRKチャネルの測定用D 20mMのK ^+（および145 mMのK ⁺細胞内）を含む細胞外液中の彼らは、強い内向き整流カリウムチャネルの重要な財産です〜-50 mVの、の逆転電位を示すべきである。野生型の電流は、カルバコールアプリケーション（基底過電流3〜5倍の増加）により強く増加し、100 mMのエタノールと同様に応答します。注：電気生理学の符号規則は、その内向き電流は負と外向き電流が正の値です。 GIRK2のアルコール結合ポケットのL257W突然変異では、カルバコールとエタノールの両方に減衰応答が表示されます。これは、L257が、アルコールとGIRK2チャネルのG蛋白質の活性化に関与していることを示唆している。 GIRK2変異誘発の結果の例については、Aryal らによる最近の出版物を参照してください^。1。

図1。野生型GIRK2記録用Clampfit 8.0に示すデータファイルのウィンドウ。左上のパネルでは、重畳異なるBAH外部ソリューションの存在下でランプ電圧のプロトコルに対応して記録されたスイープを示しています。カーソル1を-100 mVの位置に配置されます。カーソルの値は、スプレッドシート（​​右パネル）に書き込まれます。左下のパネルには現在、スイープの数対のプロットを示しています。エタノール（EtOH）およびカルバコール（炭水化物）とBa ^{2 +}と、現在の阻害と電流の増加（下向きのたわみを）注意してください。

図2。変異GIRK2 - L257W記録用Clampfit 8.0に示すデータファイルのウィンドウ。説明は、図1と同じです。カルバコール（CARB）の活性化と変異チャネルにおけるエタノール誘発性電流の削減の損失に注意してください。

Discussion

部位特異的突然変異誘発法は、イオンチャネルの構造と機能の関係を研究する古典的なアプローチです。それはイオンチャネルの重要な残基を変更することにより、一つのチャネルの機能に顕著な変化を観察することができるはずという前提に基づいています。対照的に、非クリティカルな位置に多くの変異は、チャネルの機能に大きな摂動なしで導入することができる。通常は、問題の残留物が最初にアラニン、トリプトファン、アミノ酸の最大の^2〜突然変異が続く小さな非極性アミノ酸に変異している。残留物は、チャネルの機能に重要な場合は、両方の変異がチャネル活性を変更します。あまり本質的な残基が変異している場合、特にアラニンへの変異の影響は、しばしば平凡です。トリプトファンの変異は、トリプトファンのサイズに関連付けられている立体的な支障に起因する変化を引き起こす可能性が高くなります。多くの場合、チャンネル（アラニンやトリプトファンスキャンと呼ばれる）の断片の中アラニンやトリプトファンの構造情報が不足して、体系的な変異が重要な残基を特定するために使用することができます。別の点突然変異を持つ複数のクローンを並列比較的短い時間内に複数の残基をテストするためにできるように製造することができることに注意することは重要です。最近では、チャネルの複数の結晶構造は^3,4,5利用できるようになりました。彼らは、このプロトコルで説明されているアプローチを使用してテストすることがキーとなる可能性がある残基を提案するために使用することができます。

野生型チャネル上の測定値は常にトランスフェクションし、電気生理学的実験が正しく行われたことを確実にするためのポジティブコントロールとして機能する変異体チャネルの測定を添付してください。点突然変異は、機能的な現在の不足にチャネル活性の野生型または改変された規制と同様の電流を導くことができる。測定可能な電流の欠如は、不適切な折りたたみまたは変更された人身売買に起因する可能性があります。このようなケースでは、チャネルがセルの内部留保の非機能的な細胞膜上のチャンネルとチャンネルを区別するために細胞外タグに対するビオチン化アッセイまたは免疫蛍光染色を（細胞浸透性のない）を使用して表面に正確にトラヒックのかどうかを確認すると便利な場合があります。最後に、チャネルだけでなく、チャネルの規制上の変異の影響の基底活性だけでなく、を調査することをお勧めします。チャネル機能の調節機序の異なるが、Gタンパク質、PIP2、イオン、ATP濃度、リン酸化（チロシン、セリンまたはスレオニンの変異を使用して）、ユビキチン化やSUMO化（リジンの突然変異を使用して）による規制を含む、対象のイオンチャネルの種類により研究される可能性とダイレクトチャネルオープナーまたはブロッカー。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Varies
Mini Prep Kit	Qiagen	27104
Radiacwash	Biodex	005-100
Poly-D-lysine hydrobromide	BD Biosciences	CB40210	Poly-L-lysine can also be used
Maxi Prep Kit	Qiagen	12263
QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit	Stratagene	200512-5
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
Cover slips ˆ… 12 mm	Warner Instruments	CS-12R
Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall	Warner Instruments	G150-3
Inverted fluorescence microscope	Leica	DMI3000 B
Electrophysiology	Nikon/ Leica/ Zeiss	Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B amplifier
Perfusion system	Warner Instruments	VC-6 Perfusion MM-6
Digitizer	Molecular Devices	Digidata 1320 digitizer
Manipulators	Sutter Instruments	Manipulator: MP-85
Electrode Puller	Narishige	PC10 vertical electrode puller
Isolation Table	Technical Manufacturing Corporation	Air table