Mutagenes och funktionsanalys av jonkanaler Uttryckt Heterologously i däggdjursceller

Summary

Vi kommer att visa hur man kan studera effekten av en enda mutation på funktionen av en jonkanal.

Abstract

Vi kommer att visa hur man kan studera de funktionella effekterna av att införa en punkt mutation i en jonkanal. Vi studerar G-protein-gated invärtes korrigera kalium (kallad GIRK) kanaler som är viktiga för att reglera retbarhet av nervceller. Det finns fyra olika däggdjur GIRK kanal subenheter (GIRK1-GIRK4) - vi fokuserar på GIRK2 eftersom den bildar en homotetramer. Stimulering av olika typer av G-protein-kopplade receptorer (GPCRs), som muskarin-receptor (M2R), leder till aktivering av GIRK kanaler. Alkohol också direkt aktiverar GIRK kanaler. Vi kommer att visa hur man kan mutera en aminosyra genom att specifikt förändra en eller flera nukleotider i cDNA för GIRK kanalen. Denna muterade cDNA sekvens kommer att förstärkas i bakterier, renade, och närvaron av den punkt mutationen kommer att bekräftas genom DNA-sekvensering. Den cDNAs för muterat och vildtyp GIRK kanaler kommer att transfekterade till humana embryonala celler njure HEK293T odlade in vitro. Slutligen kommer hela-cell patch-clamp elektrofysiologi användas för att studera de makroskopiska kalium strömmar genom ectopically uttryckt vildtyp eller muterade GIRK kanaler. I detta experiment kommer vi att undersöka effekten av en L257W mutation i GIRK2 kanaler på M2R-beroende och alkohol-beroende aktivering.

Protocol

1. Site Riktad Mutagenesis

Vi använder däggdjur uttryck plasmiden pcDNA3.1 kodning ett cDNA för GIRK2 och införa en punktmutation med Stratagene (Agilent Technologies) QuikChange XL II site-directed mutagenes kit, enligt tillverkarens anvisningar.

Primers sekvens kan enkelt skapas med hjälp av online-program primer design finns på:
https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15

Observera: Vi använder standard Eppendorf 1,5 ml rör i stället för BD 14 ml rör som beskrivs i protokollet. Men användningen av XL10-Guld ultracompetent E. coli förbehandlas med β-merkaptoetanol, 30 heat shock tid och NZY ⁺ (eller NZYM ⁺⁾ medier är avgörande för ett framgångsrikt mutagenes. Om möjligt kan engineering en extra tyst mutation som skapar en ny begränsning webbplats vara bekvämt för screening mutant kolonier nedan.

2. Miniprep, DNA-sekvensering och Maxiprep

2,1 Qiagen miniprep och sekvensering.

Individuella kolonier plockas och odlas i LB buljong med ampicillin (AMP). Vi följer tillverkarens anvisningar för att rena det cDNA. En enkel begränsning smälta kan användas för att bekräfta det framgångsrika införandet av mutationen, om en begränsning webbplats ingår i Steg 1 ovan. Automatiserad DNA-sekvensering görs på annan plats, och är nödvändig för att bekräfta närvaron av mutationen i cDNA, samt bedöma om det finns några oönskade mutationer. Detta steg är väldigt viktigt. Vi sekvens hela GIRK kodande sekvens användning av fram-T7 promotorn och bakåt BGH sekvensering primers som flanken flera kloning platsen för pcDNA3.1 plasmiden.

OBS: Det är viktigt att noggrant inspektera sekvensering electropherogram att garantera ett tillräckligt kvalitet sekvensering data. Hög kvalitet electropherogram har vassa, icke-överlappande toppar med lite bakgrundsljud.

2,2 Qiagen maxiprep.

Vi följer tillverkarens anvisningar.

OBS: Detta steg ingår i våra experiment för att förbättra renhet cDNA, som vi finner är viktigt för effektiv transfektion.

3. Kultur och transfektion av HEK293T celler

Alla dessa åtgärder bör ske i en steril vävnadsodling huva.

3,1 Cell kultur

HEK293T celler är bekvämt att använda eftersom de är lätta till kultur (37 ° C, 5% CO ₂ fuktas inkubator), har snabb replikering tid, hög transfektion effektivitet och kan bli föremål för hel-cell patch-clamp elektrofysiologi. HEK293T celler uttrycka SV40 stora T-antigen som garanterar episomal replikering av pcDNA3.1 plasmid.

HEK293T celler odlas i låg-glukos DMEM media kompletteras med L-glutamin och 10% fetalt bovint serum (FBS). För passaging celler, lägga till 0,25% Trypsin / EDTA till konfluenta (90-95%) HEK293T celler, vänta tills celler lossnar från vävnaden skålen, sedan stoppa enzymaktiviteten genom tillsats av färsk media som innehåller FBS /. Tavla ~ 1 X 10 ⁵ celler / brunn i en 12 väl cellkultur skålen tillsammans med 1 ml antibiotika-fri kultur medier per brunn. (1 x 10 ⁵ celler är ~ 350 mikroliter cellsuspension från konfluenta T25 kolv återsuspenderade med 10 ml media).

3,2 Transfektion

Efter 8-24 timmar, kommer HEK celler hålla sig till plast och är redo för transfektion. Transfektera celler med 0,2 mikrogram kanal cDNA, 0,4 mikrogram M2R receptorn cDNA och 0,04 mikrogram YFP cDNA med hjälp av Invitrogen Lipofectamine 2000. Observera: Vi använder en liten mängd YFP cDNA för att avgöra vilka celler som framgångsrikt transfekterade (gröna celler kommer sannolikt att innehålla både GIRK kanalerna och M2 receptorer). Koncentrationen av cDNA att använda kommer att behöva justeras för varje klon.

3,3 Fluorescens visualisering av transfekterade cellerna.

Placera 12-brunnar på scenen av ett inverterat fluorescensmikroskop, och undersöka celler för YFP uttryck. Jämför med DIC bild och anteckna ungefärligt antal gröna celler. Detta ger en uppskattning av transfektion effektivitet.

3,4 Beredning av 24-bra rätter och Poly-D-lysin belagd täckglas

Rengör 12 mm halk skyddsglaset (Warner, CS-12R) genom att skaka dem över natten med Radiacwash, följt av tvättning med avjoniserat vatten och övernattning skaka i 95% etanol. Förvara rena täckglas i 70% etanol tills det ska användas.

Placera täckglas i en petriskål med etanol, lågor av etanol med hjälp av pincett och brännare, end plats i en brunn i en steril 24 brunnar.

Täck varje brunn med 250 mikroliter av poly-D-lysin (PDL) lösning [0,2 mg / ml] och låt täckglas över natten sitter nedsänkt i PDL-lösning under sterila huva. Linda 24 brunnar i Parafilm för att undvika avdunstning.

Nästa morgon, aspirera PDL och tvätta 2x med sterilt vatten. Låt plattorna öppen för att torka under huven, täck sedan. Den 24 och rätter med belagda täckglas kan packas in med sterila aluminiumfolie och förvaras i rumstemperatur i flera veckor.

3,5 Plätering transfekterade HEK293T celler på täckglas

24h efter transfektion, dela celler i 24 brunnar skålen (~ 4 x 10 ³ celler / brunn) innehåller glas täckglas täckta med poly-D-lysin. Obs: transfekterade celler kan användas upp till 24-72 timmar efter transfektion. Cellerna är uppdelade för att ge enskilda täckglas för patch clamp elektrofysiologi experiment.

4. Elektrofysiologi

4.1 Förberedelse Lösningar

Extracellulär (bad) lösning: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM CaCl _2, 2 mm MgCl ₂ och 10 mM HEPES (pH 7,4 set med NaOH).

Alikvotera 20K bad lösning och tillsätt lämplig modulatorer

• 20K + Ba ^{2 +:} som innehåller 1 mM BaCl _2: en specifik hämmare av inåt åtgärda strömmar
• 20K + karbakol: lösning med 5 mikroM karbakol: en specifik M2R agonist, M2R par till G-proteiner som öppnar GIRK kanaler
• 20K + Etanol: bad lösning innehållande 100 mM EtOH att aktivera GIRK kanaler direkt

Placera bad lösningar till sprutor (lösning behållare) för ett snabbt utbyte perfusion system. Observera: Vi använder en Warner-system klämventil att kontrollera badet lösningar. PE slangar rekommenderas.

Intern / elektrod lösning: 140 mm KCl, 20 mM NaCl, 5 mm EGTA, 5,4 mM MgCl _2, 10 mm HEPES (pH 7,4) med 2,5 mm K ₂ ATP och 0,3 mikroM Li ₂ GTP.

Vi gör elektroden lösning utan ATP och GTP. Vi förbereder sig alikvoter av ATP och GTP, som förvaras vid -80 ° C och lägg till elektroden lösningen på dagen för experimentet. Vi håller spruta med sista elektroden lösningen på is för att bevara ATP / GTP. Vi sterila filter (0,2 mikrometer) den interna / externa lösningar för att förhindra mikrobiell tillväxt och minska risken för igensättning av rör och elektroden.

4,2 Dra elektroder

Vi använder Narishige två steg vertikala avdragare och borosilikatglas elektrod från Warner instrument (1,5 mm ytterdiameter, 0,86 mm innerdiameter och 7,5 cm lång) för att få elektroder med 3-7 Mohm av motstånd när de fylls med intracellulära lösning.

OBS: Det är nödvändigt att experimentellt bestämma parametrar för elektroden avdragaren och typ av elektrod glas i ditt lab. För våra vertikala avdragare, använder vi ett värmeläge för 60,2 för det första dra och ~ 43 för den andra dra.

4,3 Hel-cell patch fastspänning

1. Montera locket glida i en 35 mm maträtt med liten mängd vaselin, täck med extern lösning och placera skålen på scenen av ett inverterat fluorescensmikroskop. Använd DIC att fokusera och hitta celler, byta till YFP fluorescens att lokalisera YFP positiva celler.
2. Placera spetsen av perfusion mångahanda nära en grön cell (20-30 ìm från cellen av intresse = 2-3 cell längd isär).
3. Fyll elektroder med lösning, fast den på headstage av Axopatch 200B förstärkare (Axon Instruments) med följande grundinställningar: Gain 1, Configuration: helcells-β = 1, mode V-klämma.
4. Applicera en positiv press på elektroden för att förhindra igensättning av pipetten och använda roboten till platsen elektrodspetsen strax ovanför cellen.
5. För att nollställa pipett potential, välj knappen Seal Testa att leverera ett steg provspänning. Den 5 mV rektangulära spänningen steg kommer att visas i Seal Test fönster Clampex. Justera Pipettera Förskjutning potentiometern på förstärkaren för att få baslinjen ström till 0 NA. Alternativt noll pipetten potential genom att byta förstärkaren lägesväljaren till V-spår läge och mätaren ratten för att VTrack och använda Pipettera Förskjutning potentiometern på förstärkaren för att få spänning på förstärkaren mätarens display till "0,00".
6. Kontrollera motstånd på elektroden med hjälp av kommandot sigill test av den Clampex 8,2 programvaran (ska vara 3-7 Mohm).
7. Öppna en sparad protokoll fil eller skapa ett nytt protokoll. För att öppna protokoll fil väljer i huvudmenyn Hämta sedan öppna protokoll och välja en sparad fil spänning protokollet. För det här experimentet har protokollet skapats för att hålla membranpotential på-40mV, leverera ett enda 50 ms spänningen steg till -100 mV och ramp till 40 mV över 200 ms. Detta protokoll utförs varje 2 sekunder. Rampen-protokollet möjliggör observation av återföring potential och inåt rättelse av GIRK kanaler. För spänningskänsliga jonkanaler, kan en rektangulär spänning steg vara lämpligare.
8. Tillvägagångssätt cellen med hjälp av finjustering av manipulator, släpp positivt tryck, efter att röra vid cellytan gäller undertryck, och övervaka öka motståndet i Seal Test oscilloskopet fönster. När motståndet är i GΩ serien har elektroden förseglade på membran (Gigaseal har bildats).
9. Applicera en puls av undertryck för att bryta cellmembranet och få tillgång in i cellen. Väl i helcells-konfiguration, kommer du registrera ökat kapacitiva strömmar.
10. Växla till Membrane Test i Clampex och skriver ner Ra tillgång motstånd, membran motstånd Rm, membran Cm kapacitans och kontrollera med ögat den exponentiella passar den teoretiska kurvan till den verkliga capacitative ström. Membran kapacitansen är proportionell till cell storlek och kommer att användas senare för att beräkna strömtäthet.
11. Växla tillbaka till Seal Test, som V-Out (membranpotential) till -40 mV och filter vid 10 kHz
12. Kompensera för membran kapacitans och serier motstånd på förstärkaren med följande steg:
    1. Byt HELA slå CELL locket på. Justera helcells gemensamma jordbrukspolitiken och serier ringer MOTSTÅND fram och tillbaka, tills du får en platt testa puls. Du kan också behöva justera pipett kapacitans FAST CAP ratten.
    2. Slå på% FÖRUTSÄGELSE ratten till ca 60-80%, återigen nytt justera helcell gemensamma jordbrukspolitiken och den serieresistiv ratten (du kan behöva justera pipett kapacitans ersättning ratten FAST CAP också).
    3. Slå på% COMP-till 100% utan oscillerande cellen, samtidigt som man försöker hålla pulsen platt genom att åter justera helcell jordbrukspolitiken och serieresistiv (du kan behöva justera pipett kapacitans ersättning snabbt CAP ratten också). Justera fördröjningen genom att minska tiden konstant.
    4. Skriv ned värdena för Cm (membran kapacitans), RS (serie motstånd),% COMP, Pred% och Lag tiden inställd på förstärkaren i den bärbara datorn. CM och R ska vara ungefär samma som CM och Rm mäts i membranet Test ovan.
13. Sätt på extern lösning ventil för att styra badet lösningen. Ställ in förstärkarens 8-polig Bessel-filter 2kHz, öppna en spänning klämma protokoll och börja spela in strömmar.
14. Vi registrerar GIRK strömmar med hjälp av en ramp protokoll som steg till -100 mV för 50 ms därefter ramperna från 100 mV till +40 mV över 200 ms och levereras varje 2 sekunder. Rampen-protokollet möjliggör observation av återföring potential och för aktiv rättelse egendom GIRK kanaler. Vid rumstemperatur (22-25 ° C) bör GIRK nuvarande omvända nära -50 mV (med 20 mm KCl i badet), som är nära den beräknade jämvikt potential för K (E _K = -50 mV), sedan återstår ganska platt på potentialer positiva till E _K.
15. Experimentell Protokoll: Efter inspelning av en stabil baslinje, växla till lösning 20K + karbakol och vänta på toppen av svar, gå tillbaka till 20K bad lösning, sedan tillämpa 20K + Etanol och vänta på maximal känslighet, byt sedan till 20K bad lösning, och slutligen till 20K + Ba ^{2 +-lösning.} Under tillämpning av dessa läkemedel kommer du att se förändringar i amplituden GIRK strömmar (mest uttalad i -100 mV). Notera spåra numret som motsvarar tillämpningen av olika extracellulära lösningar i den bärbara datorn. En enda Clampfit filen kommer att innehålla alla de sveper för hela experimentet.

5. Data Analysis

Vi använder Clampfit 9,2 programvara för att analysera data GIRK strömmar till -100 mV.

1. Öppna filen med inspelningen, ställ markören i -100 mV. Som standard kommer du att se alla spår överlagras på skärmen. Genom att trycka på "Skriv markörer" ikon du kommer att skapa Excel-liknande kalkylblad med numeriska data.
2. Genom att tilldela X till spår nummer kolumnen och Y för att markören kolumnen och trycka på "Skapa graf"-ikonen kan du snabbt dra en gång-kurs plot av försöket.
3. Beräkna basala nuvarande genom att subtrahera ström i närvaro av Ba ^{2 +} från den löpande registreras i externa perfusion lösning ensamt ("20K nuvarande" minus "20K + Ba ^{2 +} ström"). Beräkna inducerade strömmar genom att subtrahera basala ström i 20K från aktiveras strömmar ("20K + karbakol nuvarande" minus "20K nuvarande", "20K + Etanol nuvarande" minus "20K nuvarande"). Beräkna strömtäthet (PA / PF) genom att dividera den aktuella genom membranet kapacitans (läs direkt från förstärkaren). Beräkna procent aktivering genom att dividera inducerade strömmar genom basala strömmar och multiplicera med 100.

6. Representativa resultat

Du bör kunna spela in ström från celler transfekterade med vildtyp kanaler. För GIRK kanaler mätaD i den extracellulära lösning innehållande 20 mM K ⁺ (och 145 mm K ⁺ intracellulärt) De bör uppvisa starka inåt rättelse och en återföring potential ~ -50 mV, vilket är en väsentlig egenskap av kalium kanaler. Den vildtyp nuvarande kommer att öka kraftigt på karbakol ansökan (3-5 faldig ökning över basal ström) och svara på samma sätt som 100 mm etanol. Obs: teckenkonvention för elektrofysiologi är att inåt nuvarande är negativt och utåt aktuella är positivt. För L257W mutation i alkohol bindande fickan på GIRK2 ser du försvagat svar på både karbakol och etanol. Detta tyder på att L257 är involverad i alkohol-och G-protein aktivering av GIRK2 kanaler. För ytterligare exempel på resultatet av GIRK2 mutagenes, se föregående publicering av Aryal et al. ^1.

Figur 1. Fönster av Clampfit 8,0 visar datafil för vildtyp GIRK2 inspelning. Övre vänstra panelen visar överlagrade sveper in som svar på en ramp spänning protokoll i närvaro av olika externa Bah lösningar. Markören 1 är placerad på -100 mV. Markören värden skrivs till kalkylblad (höger panel). Nedre vänstra panelen visar tomt på sopa antalet vs, ström. Notera ökningen i den nuvarande (nedåt nedböjning) med etanol (EtOH) och karbakol (CARB) och nuvarande hämning med Ba ^{2 +.}

Figur 2. Fönster av Clampfit 8,0 visar datafil för en muterad GIRK2-L257W inspelning. Beskrivningarna är samma som i Figur 1. Notera förlusten av karbakol (CARB) aktivering och minskning av EtOH-inducerade strömmar i mutant kanaler.

Discussion

Site-directed mutagenes är en klassisk metod för att studera struktur-funktionssamband av jonkanaler. Den bygger på antagandet att genom att ändra en kritisk rester av jonkanaler man ska kunna observera uttalade förändringar i kanalen funktion. Däremot kan många mutationer i icke-kritiska läge införas utan större störningar i kanalen funktion. Normalt är en restprodukt i fråga först muterade till alanin, en liten icke-polära aminosyror, följt av mutation till tryptofan, den största av aminosyror ^2. Om återstoden är viktigt att kanalen funktionen kommer både mutationer byter kanal aktivitet. Om en mindre viktig rester är muterad, effekterna av mutationen, särskilt för alanin är ofta alldaglig. Tryptofan mutationer är mer sannolikt att orsaka förändringar på grund av steriska hinder i samband med tryptofan storlek. Ofta kan då strukturell information saknas systematiska mutation till alanin eller tryptofan inom ett fragment av kanal (kallas alanin eller tryptofan skanna) användas för att lokalisera kritiska rester. Det är viktigt att notera att flera kloner med olika punktmutationer kan förberedas parallellt så att testa flera rester inom relativt kort tid. Nyligen har flera kristallstrukturer av de kanaler som blir tillgängliga ^3,4,5. De kan användas för att föreslå en potentiell nyckel rester som skall testas med den metod som beskrivs i detta protokoll.

Mätningar på vildtyp kanalen bör alltid medfölja mätning av en mutant kanal för att fungera som en positiv kontroll för att säkerställa att transfektion och elektrofysiologiska experimenten gjordes på rätt sätt. Punktmutationer kan leda till brist på en fungerande ström, en ström liknande den vildtyp eller ändrad reglering av kanalen aktivitet. Brist på mätbara ström kan bero på felaktig falsning eller ändras människohandel. I sådana fall kan det vara bra att ta reda på om kanalen trafikerar korrekt till ytan med en biotinylation analysen eller immunofluorescens färgning mot extracellulära tagg (utan cell permeabilization) att skilja mellan icke-funktionella kanaler på plasmamembranet och kanaler kvar inne i cellen . Slutligen är det lämpligt att undersöka inte bara basala aktiviteten i kanalen, men också konsekvenser av mutation på kanalen förordningen. Olika mekanismer för modulering av den kanal funktionen kunde studeras beroende på jon kanal av intresse bland annat reglering av G proteiner, PIP2, joner, ATP koncentration, fosforylering (med tyrosin, serin eller treonin mutation), ubiquitination eller sumoylation (med hjälp av lysin mutation) och direkt kanal konservöppnare eller blockerare.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Varies
Mini Prep Kit	Qiagen	27104
Radiacwash	Biodex	005-100
Poly-D-lysine hydrobromide	BD Biosciences	CB40210	Poly-L-lysine can also be used
Maxi Prep Kit	Qiagen	12263
QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit	Stratagene	200512-5
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
Cover slips ˆ… 12 mm	Warner Instruments	CS-12R
Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall	Warner Instruments	G150-3
Inverted fluorescence microscope	Leica	DMI3000 B
Electrophysiology	Nikon/ Leica/ Zeiss	Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B amplifier
Perfusion system	Warner Instruments	VC-6 Perfusion MM-6
Digitizer	Molecular Devices	Digidata 1320 digitizer
Manipulators	Sutter Instruments	Manipulator: MP-85
Electrode Puller	Narishige	PC10 vertical electrode puller
Isolation Table	Technical Manufacturing Corporation	Air table