Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

Summary

Nous allons démontrer comment étudier l'effet d'une mutation ponctuelle unique sur la fonction d'un canal ionique.

Abstract

Nous allons démontrer comment étudier les effets fonctionnels de l'introduction d'une mutation ponctuelle dans un canal ionique. Nous étudions la protéine G-dépendants de potassium intérieurement rectifier (dénommé GIRK) canaux, qui sont importants pour la régulation de l'excitabilité des neurones. Il ya quatre sous-unités différentes de mammifères canal GIRK (GIRK1-GIRK4) - nous nous concentrons sur GIRK2 parce qu'il forme un homotétramère. La stimulation de différents types de G récepteurs couplés aux protéines (RCPG), tels que le récepteur muscarinique (M2R), conduit à l'activation des canaux GIRK. L'alcool a également active directement les chaînes GIRK. Nous allons montrer comment muter un acide aminé par changer spécifiquement un ou plusieurs nucléotides dans l'ADNc pour le canal GIRK. Cette séquence mutée ADNc sera amplifié dans les bactéries, purifié, et la présence de la mutation ponctuelle sera confirmée par séquençage de l'ADN. L'ADNc pour les chaînes de GIRK muté et de type sauvage sera transfecté dans des cellules embryonnaires humaines de rein HEK293T cultivées in vitro. Enfin, la cellule entière de patch-clamp électrophysiologie seront utilisés pour étudier les courants macroscopiques de potassium par les canaux exprimé ectopiquement GIRK de type sauvage ou muté. Dans cette expérience, nous allons examiner l'effet d'une mutation dans le L257W GIRK2 canaux sur l'activation M2R-dépendants et alcoolo-dépendants.

Protocol

1. Mutagenèse dirigée

Nous utilisons des mammifères plasmide d'expression codant pour une pcDNA3.1 ADNc pour GIRK2 et d'introduire une mutation ponctuelle en utilisant Stratagene (Agilent Technologies) QuikChange XL II dirigée vers le site kit de mutagenèse, conformément aux instructions du fabricant.

Séquences amorces peuvent être facilement générés à l'aide en ligne du programme de conception d'amorce disponible à:
https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15

Note: Nous utilisons la norme Eppendorf tubes de 1,5 ml à la place des tubes BD ml 14 décrites dans le protocole. Cependant, l'utilisation de XL10-Gold ultracompetent E. coli prétraités avec β-mercaptoéthanol, 30s de temps choc thermique et NZY ⁺ (ou NZYM ⁺⁾ des médias sont essentiels pour la mutagenèse succès. Si possible, l'ingénierie d'une mutation silencieuse supplémentaires qui crée un nouveau site de restriction peut être pratique pour le dépistage colonies mutantes ci-dessous.

2. Miniprep, séquençage d'ADN et Maxiprep

2,1 Qiagen miniprep et le séquençage.

Colonies bactériennes individuelles sont cueillis et cultivés dans un bouillon LB avec ampicilline (Amp). Nous suivons les instructions du fabricant pour la purification de l'ADNc. Un condensé simple restriction peut être utilisé de confirmer l'introduction réussie de la mutation, si un site de restriction est incorporé à l'étape 1 ci-dessus. Séquençage de l'ADN automatisé est effectué hors site, et est essentielle pour confirmer la présence de la mutation dans l'ADNc, ainsi que d'évaluer s'il ya des mutations indésirables. Cette étape est très importante. Nous séquence de la séquence codante entière GIRK utilisant les marches avant et arrière promoteur T7 BGH amorces de séquençage que site de clonage multiple du flanc du plasmide pcDNA3.1.

Remarque: Il est important d'inspecter soigneusement l'électrophérogramme séquençage afin d'assurer une qualité suffisante des données de séquençage. Électrophérogramme de haute qualité a tranchants, sans chevauchement des pics de bruit de fond peu.

2,2 Qiagen maxiprep.

Nous suivons les instructions du fabricant.

Remarque: Cette étape est incluse dans nos expériences pour améliorer la pureté de l'ADNc, que nous trouvons est important pour la transfection efficace.

3. Culture et transfection de cellules HEK293T

Toutes ces mesures devraient se faire dans une hotte de culture de tissus stériles.

3.1 La culture cellulaire

Cellules HEK293T sont pratiques à utiliser car ils sont faciles à la culture (37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur humidifié), avoir le temps de réplication rapide, l'efficacité de transfection élevée et se prêtent à une cellule entière de patch-clamp électrophysiologie. Cellules HEK293T expresse antigène T de SV40 grande qui assure la réplication épisomique du plasmide pcDNA3.1.

Cellules sont cultivées en HEK293T faible glycémie milieu DMEM complété avec L-glutamine et 10% sérum de veau fœtal (FBS). Pour les cellules repiquage, ajouter 0,25% de trypsine / EDTA à cellules confluentes HEK293T (90-95%), attendez que les cellules se détachent de la vaisselle de tissu, puis arrêter l'activité enzymatique par addition de milieu frais contenant FBS /. Plate ~ 1 x 10 ⁵ cellules / puits dans un plat de 12 culture cellulaire bien ensemble avec 1 ml de milieux de culture sans antibiotique par puits. (1 x 10 ⁵ cellules est d'environ 350 pi de suspension cellulaire obtenue à partir confluentes T25 flacon resuspendu avec les médias 10 mL).

3.2 Transfection

Après 8-24 heures, les cellules HEK va adhérer à la plastique et sont prêtes pour la transfection. Cellules transfecter avec 0,2 mg de canal d'ADNc, 0,4 mg mg M2R ADNc du récepteur et 0,04 YFP ADNc en utilisant Invitrogen Lipofectamine 2000. Remarque: nous utilisons une petite quantité de YFP ADNc pour déterminer les cellules sont transfectées avec succès (cellules vertes contiennent probablement les deux canaux et les récepteurs GIRK M2). La concentration de l'ADNc d'emploi devra être ajustée pour chaque clone.

3,3 visualisation par fluorescence des cellules transfectées.

Placer la plaque de 12 puits sur la platine d'un microscope inversé à fluorescence, et d'examiner les cellules d'expression YFP. Comparez l'image de DIC et de prendre note du nombre approximatif de cellules vertes. Ceci fournit une estimation de l'efficacité de la transfection.

3.4 Préparation de 24 puits et Poly-D-lysine lamelles revêtement

Nettoyer 12 bulletins mm couvercle en verre (Warner, le CS-12R) en les secouant la nuit avec Radiacwash, suivi d'un lavage à l'eau déminéralisée et nuit secouant dans de l'éthanol à 95%. Stocker les lamelles propre dans l'éthanol à 70% jusqu'à son utilisation.

Lamelles dans un plat de Pétri avec de l'éthanol, la flamme hors éthanol à l'aide des pinces et un brûleur, uneplace d dans un puits d'une plaque de 24 stériles bien.

Couvrir chaque puits avec 250 uL de poly-D-lysine (PDL) solution [0,2 mg / ml] et laisser les lamelles reposer toute la nuit immergés dans une solution PDL sous hotte stérile. Enveloppez la plaque à 24 puits dans le Parafilm pour éviter l'évaporation.

Le lendemain matin, aspirer et laver PDL 2x avec de l'eau stérile. Laisser sécher les plaques ouverte sous le capot, puis couvrir. Les 24 plats bien avec des lamelles enduites peuvent être enveloppées dans un papier d'aluminium stérile et conservé à température ambiante pendant des semaines.

3,5 cellules transfectées Placage HEK293T sur la couverture glisse

24h après transfection, les cellules, réparties en boîte 24 puits (~ 4 X 10 ³ cellules / puits) contenant des lamelles de verre recouvertes de poly-D-lysine. Note: Les cellules transfectées peuvent être utilisés jusqu'à 24-72 heures après transfection. Les cellules sont réparties de fournir des lamelles individuelles pour patch-clamp électrophysiologie expérience.

4. Électrophysiologie

4.1 Préparation de solutions

Extracellulaire (bain) solution de: 20 mM de KCl, NaCl 140 mM, 0,5 _mM de CaCl2, MgCl2 ₂ mM et 10 mM HEPES (pH 7,4 avec NaOH jeu).

Solution du bain Aliquoter 20K et ajouter des modulateurs appropriés

• 20K + Ba ^{2 +:} solution contenant 1 mM BaCl _2: un inhibiteur spécifique de l'intérieur des courants rectifier
• 20K + carbachol: solution avec 5 uM carbachol: un agoniste de M2R spécifiques; couples M2R aux protéines G qui ouvrent des canaux GIRK
• 20K + éthanol: bain de solution contenant 100 mM de EtOH pour activer les canaux GIRK directement

Placez les solutions de bain dans des seringues (conteneurs solution) du système d'échange rapide de perfusion. Note: Nous utilisons un système de Warner vanne à manchon à contrôler les solutions de bain. Tube PE est recommandé.

Interne solution électrode /: 140 mM de KCl, 20 mM de NaCl, 5 mM EGTA, 5,4 mM _MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,4) avec 2,5 mM K ₂ ATP et 0,3 pM Li ₂ GTP.

Nous faisons la solution d'électrode sans ATP et GTP. Nous préparer séparément des aliquotes de l'ATP et GTP, qui sont stockés à -80 ° C, et ajouter à la solution d'électrode sur le jour de l'expérience. Nous gardons une seringue avec une solution d'électrode finale sur la glace pour conserver l'ATP / GTP. Nous filtre stérile (0,2 um) les solutions internes / externes pour inhiber la croissance microbienne et de réduire les risques de colmatage des tubes et l'électrode.

4.2 Tirer des électrodes

Nous utilisons Narishige deux étapes extracteur vertical et l'électrode en verre de borosilicate de Warner Instrument (1,5 mm de diamètre extérieur, 0,86 mm de diamètre interne et 7,5 cm de longueur) pour obtenir des électrodes avec 3-7 MQ de résistance quand il est rempli avec une solution intracellulaire.

Remarque: Il est nécessaire de déterminer expérimentalement les paramètres pour l'extracteur d'électrode et le type d'électrode de verre dans votre laboratoire. Pour notre extracteur vertical, nous utilisons un réglage de chaleur de 60,2 pour la première traction et ~ 43 secondes pour le pull.

4,3 cellules entières patch clamp

1. Mont lamelle dans un plat de 35 mm en utilisant petite quantité de vaseline, couvrir avec une solution externe et vaisselle lieu sur la scène d'un microscope inversé à fluorescence. Utilisez DIC à se concentrer et de trouver des cellules, passer à la YFP de fluorescence pour localiser YFP cellules positives.
2. Pointe de position du collecteur de perfusion près d'une cellule verte (20-30 um de la cellule d'intérêt = longueur cellulaire à 2-3 d'écart).
3. Remplir les électrodes avec une solution, l'attacher à la headstage des Axopatch 200B amplificateur (Axon Instruments) avec les réglages initiaux suivants: Gain 1, Configuration: cellule entière β = 1, le mode V-clamp.
4. Appliquer une pression positive sur l'électrode pour éviter le colmatage de la pipette, et l'utilisation du manipulateur de placer bout de l'électrode juste au-dessus de la cellule.
5. À zéro le potentiel de la pipette, sélectionnez le bouton test d'étanchéité pour livrer un échelon de tension d'essai. L'étape 5 mV de tension rectangulaire apparaîtra dans la fenêtre de test d'étanchéité des Clampex. Ajuster le potentiomètre Offset pipette sur l'amplificateur pour apporter la ligne de base actuelle à 0 nA. Alternativement, le potentiel de zéro pipette par la commutation du mode amplificateur sélecteur de V-track mode et le bouton de compteur à VTrack et utiliser le potentiomètre Offset pipette sur l'amplificateur d'apporter la tension sur l'écran du compteur amplificateur à "0.00".
6. Vérifier la résistance des électrodes en utilisant la commande test d'étanchéité de l'Clampex 8.2 du logiciel (qui devrait être 3-7 MQ).
7. Ouvrir un fichier sauvegardé ou protocole de créer un nouveau protocole. Pour ouvrir un fichier protocole de sélectionner dans le menu principal Acquérir Protocole puis Ouvrir et choisissez un fichier de tension enregistrées protocole. Pour cette expérience, le protocole a été créée pour détenir le potentiel de membrane au-40mV, de livrer un seul échelon de tension 50 ms à 100 mV et une rampe à +40 mV sur 200 ms. Ce protocole est exécuté toutes les 2 secondes. Le protocole de la rampe permet l'observation de la rectification renversement potentiel et vers l'intérieur des canaux GIRK. Pour les canaux ioniques voltage-dépendants, un échelon de tension rectangulaire peut être plus approprié.
8. Cellulaire approche utilisant un réglage fin du manipulateur, relâchez la pression positive, après avoir touché la surface de la cellule appliquer une pression négative, et de surveiller augmentation de la résistance dans la fenêtre de l'oscilloscope Sceau d'essai. Une fois que la résistance est dans la gamme GQ, l'électrode est scellé sur la membrane (Gigaseal a formé).
9. Appliquer une impulsion de pression négative à briser la membrane cellulaire et tu auras accès dans la cellule. Une fois dans la configuration cellule entière, vous devrez vous inscrire augmenté courants capacitifs.
10. Passer au test membranaire dans Clampex et écrivez la résistance d'accès RA, RM résistance de la membrane, capacitance membranaire Cm et vérifier par l'œil de l'ajustement exponentiel de la courbe théorique pour le courant réel capacitive. Capacitance membranaire est proportionnelle à la taille des cellules et seront utilisés plus tard pour calculer la densité de courant.
11. Revenez au Sceau d'essai, ensemble V-Out (potentiel de membrane) à -40 mV et le filtre à 10 kHz
12. Compenser capacitance membranaire et la résistance série sur l'amplificateur avec les étapes suivantes:
    1. Mettre l'interrupteur de cellules entières de la PAC sur. Ajuster la PAC de cellules entières et des cadrans Résistance série aller-retour, jusqu'à obtenir une impulsion de test à plat. Vous pouvez aussi avoir besoin d'ajuster la capacité pipette PAC bouton FAST.
    2. Allumez le bouton PRÉVISION% à environ 60-80%, de nouveau ré-ajuster la PAC à germes entiers et le cadran résistance série (que vous pouvez avoir à ajuster la capacité de compensation de la PAC pipette FAST bouton aussi).
    3. Allumez% COMP à 100% sans osciller la cellule, tout en essayant de garder le pouls à plat par ré-ajuster la PAC cellule entière et résistance série (que vous pouvez avoir à ajuster la capacité de compensation de la PAC pipette bouton FAST ainsi). Réglez le décalage en réduisant la constante de temps.
    4. Notez les valeurs de Cm (capacitance membranaire), R (résistance série), COMP%,% PRED et l'heure Lag mis sur l'amplificateur dans le carnet. Le CM et Rs doit être approximativement le même que le Cm et Rm mesurée dans le test ci-dessus la membrane.
13. Allumez le robinet solution externe pour contrôler la solution du bain. Régler l'amplificateur à 8 pôles du filtre de Bessel à 2 kHz, ouvrez un protocole voltage des courants et de commencer l'enregistrement.
14. Nous enregistrons les courants GIRK utilisant un protocole de la rampe que les étapes à -100 mV pendant 50 ms, puis des rampes de 100 mV à 40 mV plus de 200 ms et est livré toutes les 2 secondes. Le protocole de la rampe permet l'observation du potentiel d'inversion et de la propriété des chaînes de rectification entrante GIRK. A température ambiante (22-25 ° C), le GIRK actuelle devrait revenir près de -50 mV (avec 20 mM de KCl dans le bain), qui est proche du potentiel d'équilibre calculé pour K (E _K = -50 mV), puis reste assez plat aux potentiels positifs à E _K.
15. Protocole expérimental: Après avoir enregistré une base stable, passer à la solution 20K + carbachol et attendre pic de la réponse, revenez à 20K solution du bain, puis appliquez 20K + éthanol et d'attendre la réponse de crête, puis passer à 20K solution du bain, et enfin à 20K + Ba ^{2 +} solution. Lors de l'application de ces médicaments, vous verrez des changements dans l'amplitude des courants GIRK (plus prononcé à -100 mV). Notez le numéro de trace correspondant à l'application de différentes solutions extracellulaires dans le carnet. Un fichier Clampfit unique contient toutes les balayages pour l'expérience entière.

5. Analyse des données

Nous utilisons des logiciels Clampfit 9,2 pour analyser les données courants GIRK à -100 mV.

1. Ouvrez le fichier avec l'enregistrement, réglez le curseur à -100 mV. Par défaut, vous verrez toutes les traces superposées sur l'écran. En appuyant sur "Ecrire curseurs" icône vous permettra de créer de type Excel feuille de calcul avec des données numériques.
2. En assignant X à la colonne numéro de trace et Y pour la colonne du curseur et en appuyant sur "Créer un graphique" icône, vous pouvez dessiner rapidement un complot temps long de l'expérience.
3. Calculer le courant basale en soustrayant actuelle en présence de Ba ^{2 +} à partir en cours enregistrées dans la solution de perfusion externe seule ("20K actuelle" moins "20K + Ba ^{2 +} en cours»). Calculer les courants induits par soustraction actuelle basale 20K à partir des courants activé ("20K + carbachol actuelle" moins "20K actuelle"; "20K + éthanol actuelle" moins "20K actuelle"). Calculer la densité de courant (pA / pF) en divisant le cours par capacitance membranaire (lire directement à partir de l'amplificateur). Calculer activation pour cent en divisant les courants induits par les courants de base et en multipliant par 100.

6. Les résultats représentatifs

Vous devriez être capable d'enregistrer courant de cellules transfectées avec les canaux de type sauvage. Pour GIRK canaux de mesureD dans la solution extracellulaire contenant 20 mM K ⁺ (et 145 mM de K ⁺ intracellulaire), ils devraient montrer une forte rectification entrante et un potentiel d'inversion du ~ -50 mV, ce qui est une propriété essentielle des canaux potassiques. Le courant de type sauvage va augmenter fortement sur l'application de carbachol (3-5 fois plus élevé au cours actuel basale) et réagissent de façon similaire à l'éthanol à 100 mM. Remarque: la convention de signe pour l'électrophysiologie est que le courant entrant est négatif et le courant extérieur est positif. Pour la mutation L257W dans la poche de liaison de l'alcool GIRK2, vous verrez les réponses atténué à la fois le carbachol et l'éthanol. Ceci suggère que L 257 est impliqué dans l'alcool et l'activation de la protéine G GIRK2 canaux. Pour d'autres exemples des résultats de GIRK2 mutagenèse, voir la publication récente par Aryal et al. ^1.

Figure 1. Fenêtre des données montre Clampfit 8,0 fichier pour l'enregistrement GIRK2 de type sauvage. Panneau supérieur gauche montre superposées balaie enregistrés en réponse à un protocole de tension de la rampe, en présence de différentes solutions externes Bah. Curseur 1 est positionné à -100 mV. Les valeurs du curseur sont écrites au tableau (à droite). Panneau inférieur gauche montre le graphique représentant le nombre de balayage vs, actuel. Notez l'augmentation du courant (déviation vers le bas) avec de l'éthanol (EtOH) et le carbachol (CARB) et l'inhibition de courant avec Ba ^{2 +.}

Figure 2. Les descriptions des fenêtres Clampfit données montre 8,0 fichier pour un mutant GIRK2-L257W enregistrement. Sont les mêmes que dans la figure 1. Notez la perte de carbachol (Carb) d'activation et de la réduction d'EtOH courants induits dans les canaux de mutant.

Discussion

La mutagenèse dirigée est une approche classique pour étudier les relations structure-fonction des canaux ioniques. Il est basé sur la prémisse que, en changeant un résidu critique du canal ionique on devrait être capable d'observer des changements prononcés dans la fonction de canal. En revanche, de nombreuses mutations non-critique de position peuvent être introduits sans perturbations majeures à la fonction de canal. Typiquement, le résidu en question est d'abord muté en alanine, un petit non polaires des acides aminés, suivi par une mutation au tryptophane, la plus importante d'acides aminés ^2. Si le résidu est importante pour la fonction de canal, les deux mutations va changer l'activité du canal. Si un résidu moins essentiel est muté, les effets de la mutation, en particulier à l'alanine sont souvent anodins. Mutations tryptophane sont plus susceptibles de causer des changements à cause de problèmes stériques associés à la taille de tryptophane. Souvent, lorsque l'information structurelle est manquant, la mutation systématique de l'alanine ou de tryptophane dans un fragment de canal (appelé alanine ou tryptophane scan) peut être utilisé pour localiser les résidus critiques. Il est important de noter que les clones multiples avec différentes mutations ponctuelles peuvent être préparés en parallèle permettant de dépistage de résidus multiples dans des délais relativement courts. Récemment, plusieurs structures cristallines des canaux sont devenus disponibles ^3,4,5. Ils peuvent être utilisés pour proposer potentiels résidus clés pour être testés en utilisant l'approche décrite dans ce protocole.

Les mesures sur le canal de type sauvage doit toujours accompagner la mesure d'un canal de mutant pour servir de contrôle positif pour s'assurer que les expériences de transfection et électrophysiologiques ont été effectués correctement. Des mutations ponctuelles peuvent conduire à un manque d'un courant fonctionnelle, un projet similaire en cours à la régulation de type sauvage ou altéré de l'activité du canal. Manque de courant mesurable peut être dû au trafic de pliage ou modifié incorrecte. Dans un tel cas il peut être utile pour savoir si le canal trafics correctement à la surface en utilisant un dosage biotinylation ou immunofluorescence contre le tag extracellulaire (sans perméabilisation cellulaire) faire la distinction entre non-fonctionnelles des canaux sur la membrane plasmique et des canaux de retenue à l'intérieur de la cellule . Enfin, il est conseillé d'étudier non seulement l'activité basale du canal, mais aussi les conséquences de la mutation sur la régulation des canaux. Différents mécanismes de modulation de la fonction de canal pourrait être étudiée en fonction du canal ionique d'intérêt, y compris la régulation par les protéines G, PIP2, des ions, la concentration en ATP, la phosphorylation (en utilisant la tyrosine, sérine thréonine ou mutation), l'ubiquitination ou sumoylation (en utilisant la mutation lysine) et ouvreurs de canaux directs ou bloquants.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Varies
Mini Prep Kit	Qiagen	27104
Radiacwash	Biodex	005-100
Poly-D-lysine hydrobromide	BD Biosciences	CB40210	Poly-L-lysine can also be used
Maxi Prep Kit	Qiagen	12263
QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit	Stratagene	200512-5
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
Cover slips ˆ… 12 mm	Warner Instruments	CS-12R
Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall	Warner Instruments	G150-3
Inverted fluorescence microscope	Leica	DMI3000 B
Electrophysiology	Nikon/ Leica/ Zeiss	Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B amplifier
Perfusion system	Warner Instruments	VC-6 Perfusion MM-6
Digitizer	Molecular Devices	Digidata 1320 digitizer
Manipulators	Sutter Instruments	Manipulator: MP-85
Electrode Puller	Narishige	PC10 vertical electrode puller
Isolation Table	Technical Manufacturing Corporation	Air table