Summary
אנו מדגימים כיצד ללמוד את ההשפעה של מוטציה נקודה אחת על התפקוד של ערוץ יון.
Abstract
אנו מדגימים כיצד לחקור את ההשפעות תפקודית של החדרת מוטציה טעם ערוץ יון. אנחנו לומדים G-חלבון מגודרת אשלגן לתיקון כלפי פנים (המכונה GIRK) ערוצים, אשר חשובים להסדרת רגישות של נוירונים. ישנם ארבעה יונקים שונים ערוץ GIRK יחידות משנה (GIRK1-GIRK4) - אנו מתמקדים GIRK2 כי זה יוצר homotetramer. גירוי של סוגים שונים של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), כגון הקולטן muscarinic (M2R), מוביל ההפעלה של ערוצי GIRK. אלכוהול גם ישירות מפעילה ערוצי GIRK. אנו מראים כיצד להשתנות חומצה אמינית אחת על ידי שינוי ספציפי אחד או יותר נוקלאוטידים ב cDNA לערוץ GIRK. רצף זה cDNA מוטנטי יהיה מוגבר של חיידקים, מטוהרים, ואת הנוכחות של מוטציה נקודת יאושר על ידי רצפי DNA. CDNAs עבור ערוצי מוטציה ו wild-type GIRK יהיה transfected לתוך עובריים אנושיים לתאי כליה HEK293T תרבותי במבחנה. לבסוף, כל תא תיקון-clamp electrophysiology ישמש כדי לחקור את זרמי אשלגן מאקרוסקופיים בצינורות הביע ectopically GIRK wild-type או מוטציה. בניסוי זה, נבחן את ההשפעה של מוטציה ב L257W GIRK2 ערוצים ההפעלה M2R תלויי ואלכוהול תלויי.
Protocol
1. האתר בימוי mutagenesis
אנו משתמשים בביטוי יונקים פלסמיד pcDNA3.1 קידוד cDNA עבור GIRK2 ולהציג מוטציה נקודתית באמצעות Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL אתר מכוונת השנייה ערכה mutagenesis, על פי הוראות היצרן.
רצף primers ניתן להפיק בקלות באמצעות תחל תוכנית עיצוב באינטרנט בכתובת:
https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15
הערה: אנו משתמשים תקן Eppendorf 1.5 צינורות מ"ל במקום BD 14 צינורות מ"ל שתואר בפרוטוקול. עם זאת, השימוש XL10-Gold E. ultracompetent coli pretreated עם mercaptoethanol-β, ה -30 הלם החום זמן NZY + (או NZYM +) כלי התקשורת הם קריטיים עבור mutagenesis מוצלח. אם אפשר, הנדסה מוטציה שקטה נוספים יוצר אתר הגבלה חדש יכול להיות נוח להקרנה מושבות מוטציה להלן.
2. Miniprep, רצפי DNA ו Maxiprep
2.1 Qiagen miniprep וסדר.
מושבות חיידקים בודדים נקטפים גדל במרק LB עם אמפיצילין (AMP). אנו עוקבים אחר הוראות היצרן עבור טיהור cDNA. לעכל מגבלה פשוטה ניתן להשתמש לאשר את כניסתה המוצלחת של המוטציה, אם אתר הגבלה נכלל שלב 1 לעיל. אוטומטי רצפי DNA נעשה מחוץ לאתר, והוא חיוני כדי לאשר את קיומו של המוטציה של cDNA, כמו גם להעריך אם ישנם מוטציות לא רצויות. שלב זה חשוב מאד. אנחנו רצף רצף GIRK כל קידוד באמצעות האמרגן T7 קדימה ולהפוך primers רצף BGH כי שיבוט מרובים האגף האתר של pcDNA3.1 פלסמיד.
הערה: חשוב בזהירות לבדוק את electropherogram רצף מספיק כדי להבטיח איכות של הנתונים רצף. Electropherogram באיכות גבוהה יש חדות, שאינן חופפות פסגות עם מעט רעשי רקע.
2.2 Qiagen maxiprep.
אנו עוקבים אחר הוראות היצרן.
הערה: שלב זה נכלל בניסויים שלנו כדי לשפר את הטוהר של cDNA, אשר אנו מוצאים חשוב transfection יעיל.
3. התרבות של תאים transfection HEK293T
כל הצעדים האלה צריכים להיעשות ברדס רקמה סטרילית תרבות.
3.1 תא תרבות
תאים HEK293T הם נוחים לשימוש משום שהם קלים תרבות (37 מעלות, 5% CO 2 באינקובטור humidified), יש זמן שכפול מהיר, יעילות transfection גבוהה ניתנים electrophysiology תיקון-clamp כל תא. תאים HEK293T להביע SV40 אנטיגן T גדול מבטיח שכפול episomal של pcDNA3.1 פלסמיד.
תאים בתרבית הם HEK293T נמוכה גלוקוז DMEM התקשורת בתוספת גלוטמין-L ו -10% בסרום שור עוברית (FBS). עבור תאים passaging, להוסיף 0.25% טריפסין / EDTA כדי ומחוברות (90-95%) תאים HEK293T, לחכות עד תאים להתנתק המנה רקמות, ולאחר מכן להפסיק את פעילות האנזים על ידי תוספת של התקשורת טרי המכיל FBS /. פלייט ~ 1 X 10 5 תאים / גם לתוך צלחת 12 תרבות היטב התא יחד עם 1 מ"ל של אנטיביוטיקה ללא מדיה לכל תרבות היטב. (1 X 10 5 תאים ~ 350 μL ההשעיה התא המתקבל בקבוק T25 ומחוברות resuspended עם 10 התקשורת מ"ל).
3.2 transfection
לאחר 8-24 שעות, תאים HEK תדבק הפלסטיק והם מוכנים transfection. תאים Transfect עם ערוץ 0.2 מיקרוגרם cDNA, 0.4 מיקרוגרם M2R קולטן cDNA ו - 0.04 מיקרוגרם YFP cDNA באמצעות Invitrogen Lipofectamine 2000. הערה: אנו משתמשים בכמות קטנה של YFP cDNA כדי לקבוע אילו תאים transfected בהצלחה (תאים ירוקים צפוי להכיל גם ערוצי GIRK ואת הקולטנים M2). הריכוז של cDNA להשתמש יצטרכו להיות מותאמים עבור כל אחד לשבט.
3.3 ויזואליזציה של תאים transfected פלואורסצנטי.
מקום 12 גם צלחת על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה, ולבחון תאים לביטוי YFP. השווה את התמונה DIC ולעשות לב המספר המשוער של תאים ירוקים. זה מספק אומדן של יעילות transfection.
3.4 הכנת 24 מנות היטב Poly-D-ליזין תלושי לכסות מצופה
ניקוי זכוכית 12 מ"מ מכסה מחליק (וורנר, CS-12R) על ידי רועדת להם לילה עם Radiacwash, ואחריו כביסה עם מים deionized ולינה רועד אתנול 95%. אחסן את תלושי לכסות נקי באתנול 70% עד לשימוש.
לכסות את המקום תלושי בצלחת פטרי עם אתנול, מעל להבה אתנול באמצעות מלקחיים צורב,ד מקום אחד גם צלחת 24 סטרילית היטב.
מכסים היטב עם כל μL 250 של פולי-D-ליזין (PDL) פתרון [0.2 מ"ג / מ"ל] ולתת את תלושי לכסות לשבת שקוע לילה מתחת למכסה המנוע בתמיסה סטרילית PDL. לעטוף היטב את הצלחת ב 24 Parafilm כדי למנוע אידוי.
למחרת בבוקר, לשאוב PDL 2x ולשטוף עם מים סטריליים. השאירו צלחות פתוח יבש מתחת למכסה המנוע, ואז לכסות. 24 המנות היטב עם מכסה מחליק מצופה יכול להיות עטופים ברדיד אלומיניום סטרילי לאחסן בטמפרטורת החדר במשך שבועות.
3.5 transfected ציפוי HEK293T תאים על העטיפה תלושי
24 שעות אחרי תאים, פיצול transfection לתוך צלחת 24 היטב (~ 4 X 10 3 תאים / טוב) המכיל מכסה זכוכית תלושי מצופה פולי-D-ליזין. הערה: תאים transfected יכול לשמש עד transfection 24-72 שעות לכתוב. התאים מחולקים לספק תלושי לכסות הפרט לצורך הניסוי תיקון electrophysiology מהדק.
4. Electrophysiology
4.1 פתרונות הכנת
פתרון תאיים (אמבטיה): 20 מ"מ KCl, NaCl 140 מ"מ, 0.5 מ"מ CaCl 2, 2 מ"מ MgCl 2 ו - 10 HEPES מ"מ (7.4 pH מוגדר עם NaOH).
20K Aliquot אמבטיה פתרון ולהוסיף מאפננים הולם
- 20K + Ba 2 +: תמיסה המכילה 1 mM BaCl 2: מעכב ספציפי של זרמים לתיקון כלפי פנים
- 20K + Carbachol: פתרון עם 5 מיקרומטר Carbachol: אגוניסט M2R מסוים; זוגות M2R ל-G-חלבונים ערוצים פתוחים GIRK
- 20K + אתנול: אמבטיה תמיסה המכילה 100 EtOH mM להפעלת ערוצי GIRK ישירות
אמבטיה המקום פתרונות לתוך מזרקים (מכולות פתרון) של מערכת החליפין המהירה זלוף. הערה: אנו משתמשים במערכת שסתום קורט וורנר לשלוט פתרונות אמבטיה. צינורות PE מומלץ.
אלקטרודה פנימית / פתרון: 140 מ"מ KCl, NaCl 20 מ"מ, 5 מ"מ EGTA, 5.4 mM MgCl 2, 10 HEPES מ"מ (pH 7.4) עם 2.5 mM K 2 ATP ו - 0.3 מיקרומטר לי 2 GTP.
אנחנו עושים את הפתרון אלקטרודה ללא ATP ו - GTP. אנחנו בנפרד להכין aliquots של ה-ATP ו GTP, אשר מאוחסנים -80 ° C, ולהוסיף לפתרון אלקטרודה ביום הניסוי. אנחנו שומרים על המזרק עם אלקטרודה פתרון הסופי על הקרח כדי לשמר את ה-ATP / GTP. אנחנו סינון סטרילי (0.2 מיקרומטר) הפתרונות פנימי / חיצוני ומעכבים התפתחותם של חיידקים ולהקטין אפשרות של חסימת צינורות האלקטרודה.
4.2 אלקטרודות משיכת
אנו משתמשים Narishige שני שלבים חולץ אנכית אלקטרודת הזכוכית בורוסיליקט מ וורנר Instrument (1.5 מ"מ קוטר חיצוני, קוטר פנימי 0.86 מ"מ אורך 7.5 ס"מ) כדי להשיג אלקטרודות עם 3-7 MΩ ההתנגדות כאשר התמלאו פתרון תאיים.
הערה: יש צורך בניסוי לקבוע פרמטרים חולץ את האלקטרודה ואת סוג של זכוכית אלקטרודה במעבדה שלך. עבור חולץ אנכי שלנו, אנו משתמשים הגדרה חום של 60.2 עבור למשוך הראשון ~ 43 עבור למשוך את השני.
4.3 שלמות התא תיקון clamping
- הר לכסות להחליק בצלחת 35 מ"מ באמצעות כמות קטנה של וזלין, מכסים פתרון חיצוני צלחת מקום על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה. השתמש DIC להתמקד ולמצוא תאים, לעבור YFP פלואורסצנטי כדי לאתר תאים חיובי YFP.
- מיקום קצה סעפת זלוף ליד תא ירוק (20-30 מיקרומטר מהתא של = אורך עניין תא בנפרד 2-3).
- אלקטרודות עם פתרון מלא, וצרף אותו headstage של מגבר 200B Axopatch (מכשירים אקסון) עם ההגדרות הראשונית הבאים: רווח 1, תצורה: כל תא β = 1, מצב ה-V-clamp.
- להפעיל לחץ חיובי על אלקטרודה כדי למנוע סתימת של פיפטה, ולהשתמש מניפולטור למקום קצה האלקטרודה מעל התא.
- כדי לאפס את הפוטנציאל פיפטה, בחר את הבדיקה חותם כפתור לספק מתח שלב הבדיקה. הצעד 5 mV מתח מלבני יופיע בחלון חותם מבחן Clampex. התאם את potentiometer פיפטה קיזוז על המגבר להביא את בסיס קו הנוכחית NA 0. לחלופין, לאפס את הפוטנציאל פיפטה ידי מעבר למצב מגבר בורר למצב V-לעקוב הידית מטר כדי Vtrack ולהשתמש potentiometer פיפטה קיזוז על המגבר להביא את המתח על התצוגה מגבר מטר כדי "0.00".
- בדוק התנגדות של אלקטרודה בדיקה באמצעות חותם הפקודה של התוכנה Clampex 8.2 (צריך להיות 3-7 MΩ).
- פתיחת קובץ או פרוטוקול הציל ליצור פרוטוקול חדש. כדי לפתוח קובץ פרוטוקול לבחור מהתפריט הראשי רוכשת פרוטוקול פתוח אז לבחור פרוטוקול שנשמר בקובץ מתח. לצורך ניסוי זה, פרוטוקול נוצר להחזיק פוטנציאל הממברנה ב-40mV, לספק צעד אחד 50 ms מתח -100 mV ו הרמפה כדי 40 mV מעל 200 ms. פרוטוקול זה מבוצע כל 2 שניות. פרוטוקול הרמפה מאפשר תצפית של תיקון היפוך הפוטנציאל של ערוצים GIRK פנימה. עבור מתח מגודרת תעלות יונים, צעד מתח מלבני עשוי להיות מתאים יותר.
- תא הגישה באמצעות התאמת קנס של המניפולטור, לשחרר לחץ חיובי, לאחר נגיעה פני התא להפעיל לחץ שלילי, לפקח עליה התנגדות בחלון מבחן חותם אוסצילוסקופ. לאחר התנגדות הוא בטווח GΩ, האלקטרודה יש אטום על הממברנה (Gigaseal יצרה).
- החלת הדופק של לחץ שלילי כדי לשבור את קרום התא ולקבל גישה אל תוך התא. לאחר בתצורת כל תא, תוכלו לרשום עלייה זרמים קיבולי.
- מעבר מבחן ממברנה ב Clampex ורשמו את התנגדות גישה Ra, Rm התנגדות הממברנה, קיבול ס"מ קרום ולאמת בעין להתאים מעריכי של העקום התיאורטי הנוכחי capacitative אמיתי. קיבול ממברנה הוא יחסי לגודל התא ישמש מאוחר יותר לחשב את צפיפות זרם.
- החלף חזרה חותם מבחן, קבע V-Out (פוטנציאל ממברנה) כדי mV -40 ולסנן ב 10 קילוהרץ
- פיצוי על קיבול הממברנה והתנגדות סדרה על המגבר עם השלבים הבאים:
- החלפת ותא שלם CAP לעבור הלאה. התאם CAP ותא שלם והתנגדות מחייג סדרת הלוך ושוב, עד שאתה מקבל הדופק לבדוק שטוח. ייתכן שיהיה עליך להתאים את הידית פיפטה FAST קיבול CAP.
- הפעל את הידית חיזוי% עד כ -% 60-80, שוב מחדש התאמת CAP CELL שלם ההתנגדות סדרת חיוג (ייתכן שיהיה עליך להתאים את הפיצוי פיפטה קיבול FAST CAP הידית גם כן).
- הפעל COMP% ל 100% בלי נדנוד התא, בעוד מנסה לשמור על הדופק הדירה על ידי CAP מחדש התאמת תאים שלמים עמידות SERIES (ייתכן שיהיה עליך להתאים את הפיצוי פיפטה קיבול ידית FAST CAP גם כן). התאם את הפיגור על ידי צמצום הזמן קבוע.
- רשום את ערכי ס"מ (קיבול קרום), Rs (התנגדות סדרה), COMP%,% PRED זמן בעומר להגדיר על המגבר במחברת. ס"מ ו Rs צריך להיות בערך זהה ס"מ ועל חדר נמדד במבחן ממברנה לעיל.
- הפעל שסתום פתרון חיצוני לשלוט פתרון אמבטיה. הגדר את המגבר 8-מוט בסל מסנן 2kHz, לפתוח פרוטוקול מהדק מתח ולהתחיל זרמים ההקלטה.
- אנו רושמים זרמים GIRK באמצעות פרוטוקול הרמפה כי צעדים -100 mV עבור 50 ms אז רמפות מן mV 100 ל 40 mV מעל 200 ms ו מועבר כל 2 שניות. פרוטוקול הרמפה מאפשר תצפית של פוטנציאל היפוך ועל רכוש תיקון פנימי של ערוצי GIRK. בטמפרטורת החדר (22-25 ° C), GIRK הנוכחי צריך להפוך ליד -50 mV (עם KCl 20 mM באמבטיה), שנמצא קרוב לפוטנציאל שיווי המשקל מחושב עבור K (ה K = -50 mV), ואז יישארו שטוח למדי על פוטנציאל חיובי E K.
- פרוטוקול הניסוי: לאחר הקלטה בסיסית יציבה, עבור פתרון 20K + Carbachol ולחכות השיא של תגובה, לחזור פתרון 20K אמבטיה, ולאחר מכן להחיל 20K אתנול + ולחכות בתגובה שיא, ולאחר מכן לעבור לפתרון 20K אמבטיה, ולבסוף 20K + Ba 2 + פתרון. במהלך היישום של תרופות אלה תוכלו לראות שינויים משרעת של GIRK זרמים (מבוטא ביותר ב -100 mV). שים לב למספר עקבות המתאים היישום של פתרונות תאיים שונים במחברת. קובץ Clampfit אחד יכיל את כל מטאטא לצורך הניסוי כולו.
5. ניתוח נתונים
אנו משתמשים Clampfit 9.2 תוכנה לניתוח נתונים GIRK זרמים ב -100 mV.
- פתח את הקובץ עם ההקלטה, הגדר הסמן ב -100 mV. כברירת מחדל, תוכל לראות את כל עקבות מעולף על גבי המסך. על ידי לחיצה על "כתוב סמנים" סמל תיצור דמוי גיליון אלקטרוני של Excel עם נתונים מספריים.
- על ידי הקצאת X לעמודה עקבות מספר ו-Y העמודה הסמן ולחיצה על "יצירת גרף" סמל אתה יכול לצייר במהירות העלילה זמן מהלך הניסוי.
- חישוב הבסיס הנוכחי על ידי הפחתת הנוכחי בנוכחות של Ba 2 + מ הנוכחי נרשם זלוף פתרון חיצוני בלבד ("20K הנוכחי" מינוס "20K + Ba 2 + הנוכחי"). חישוב זרמים המושרה על ידי הפחתת הנוכחית הבסיס ב 20K מן הזרמים הופעל ("20K + Carbachol הנוכחי" מינוס "20K הנוכחי", "20K + אתנול הנוכחי" מינוס "20K הנוכחית"). חישוב צפיפות זרם (רש"פ / PF) על ידי חלוקת הנוכחי על ידי קיבול הממברנה (קריאה ישירות למגבר). חישוב אחוז הפעלה על ידי חלוקת זרמים המושרה על ידי זרמי הבסיס, על ידי הכפלת 100.
6. נציג תוצאות
אתה אמור להיות מסוגל להקליט הנוכחית מתאי transfected עם wild-type ערוצים. בשביל למדוד ערוצי GIRKד בתמיסה המכילה תאית 20 mM K + (ו 145 mM K + תאיים) הם צריכים להפגין תיקון פנימי חזק פוטנציאל היפוך של -50 mV ~, המהווה נכס מהותי של תעלות אשלגן. הנוכחית wild-type יגדיל מאוד על carbachol יישומים (גידול של פי 3-5 על הבסיס הנוכחי) ולהגיב באופן דומה אתנול 100 מ"מ. הערה: האמנה סימן electrophysiology היא כי זרם פנימה היא שלילית הנוכחית כלפי חוץ היא חיובית. לגבי המוטציה L257W בכיס אלכוהול מחייב GIRK2, תראה תגובות נחלש אל carbachol וגם אתנול. הדבר מצביע על כך L257 מעורב אלכוהול הפעלת חלבון G של GIRK2 ערוצים. לדוגמאות נוספות של תוצאות mutagenesis GIRK2, ראה פרסום לאחרונה על ידי Aryal et al. 1.
באיור 1. חלון של קובץ Clampfit 8.0 הנתונים מראה הקלטה wild-type GIRK2. הפאנל השמאלי העליון ניתן לראות על גבי מטאטא נרשם בתגובה פרוטוקול רמפה מתח בנוכחות של פתרונות חיצוניים שטויות שונים. הסמן 1 ממוקמת -100 mV. ערכי הסמן נכתבות הגיליון האלקטרוני (פאנל העכבר). הפאנל השמאלי התחתון מציג את העלילה של מספר לטאטא לעומת, הנוכחית. הערה הגידול הנוכחי (הטיה כלפי מטה) עם אתנול (EtOH) ו carbachol (פחמימות) ועיכוב הנוכחי עם Ba 2 +.
איור 2. תיאורי חלון של קובץ Clampfit 8.0 הנתונים מראה להקלטת GIRK2-L257W מוטציה. הם כמו באיור 1. הערה אובדן ההפעלה (פחמימות) carbachol וצמצום EtOH-Induced זרמים ערוצי מוטציה.
Discussion
אתר מכוונת mutagenesis היא גישה קלאסית ללמוד מבנה תפקודי מערכות יחסים של תעלות יונים. היא מבוססת על ההנחה כי על ידי שינוי משקע קריטי של ערוץ יון אחד צריך להיות מסוגל לצפות שינויים בולטים בתפקוד הערוץ. לעומת זאת, מוטציות רבות במצב שאינם קריטיים ניתן הציג ללא הפרעות הגדולות לתפקד הערוץ. בדרך כלל, שאריות המדובר הוא מוטציה הראשון אלאנין, חומצה קטן קוטבי אמינו, ואחריה מוטציה כדי טריפטופן, הגדולה ביותר של חומצות אמינו 2. אם השארית היא חשובה לתפקוד הערוץ, מוטציות הן ישתנו פעילות הערוץ. אם שאריות חיוני פחות עובר מוטציה, את ההשפעות של מוטציה, במיוחד אלאנין הם לעתים קרובות חסרי ייחוד. מוטציות טריפטופן נוטים יותר לגרום לשינויים עקב מכשולים סטרית קשור לגודל טריפטופן. לעתים קרובות, כאשר את המידע מבניים חסר, מוטציה שיטתית אלאנין או טריפטופן בתוך שבר של הערוץ (הנקרא טריפטופן אלאנין או סריקה) ניתן להשתמש כדי לאתר שאריות קריטי. חשוב לציין כי שיבוטים מרובים עם מוטציות נקודתיות שונות ניתן להכין במקביל המאפשר בדיקות שאריות מרובות תוך זמן קצר יחסית. לאחרונה, מבנים גבישיים שונים של הערוצים נהיו זמינים 3,4,5. הם יכולים לשמש להציע שאריות מפתח פוטנציאל להיבדק באמצעות הגישה המתוארת פרוטוקול זה.
מדידות בערוץ wild-type תמיד צריך ללוות את המדידה של ערוץ מוטציה לשמש מלאה חיובית להבטיח כי הניסויים transfection ו אלקטרו נעשו כראוי. מוטציות פוינט עשויה להוביל לחוסר הנוכחית פונקציונלי, דומה הנוכחי הסדרת wild-type או שינוי של פעילות הערוץ. חוסר הנוכחית למדידה יכול להיות בגלל סחר מתקפלים או שינו פסולים. במקרה כזה הוא עשוי להיות שימושי כדי לברר אם הערוץ traffics נכונה אל פני השטח באמצעות assay biotinylation או מכתים immunofluorescence נגד תג תאיים (ללא permeabilization התא) כדי להבחין בין שאינם פונקציונליים ערוצים הממברנה פלזמה ערוצי שמר בתוך התא . לבסוף, רצוי לחקור לא רק את הבסיס לפעילות של הערוץ, אלא גם ההשלכות של מוטציה על תקנה את הערוץ. מנגנונים שונים של אפנון של הפונקציה ערוץ יכול להיות למד בהתאם הערוץ יון עניין כולל רגולציה על ידי חלבוני G, PIP2, יונים, ריכוז ה-ATP, זירחון (באמצעות, טירוזין סרין או תראונין מוטציה), או ubiquitination sumoylation (באמצעות מוטציה ליזין) ואת ההתחלה ערוץ ישיר או חוסמי.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
העבודה שלנו התאפשר הודות לתמיכה כספית מן הקרן קרן מק 'נייט למדעי המוח (PAS), המכון הלאומי לשימוש בסמים (R01 DA019022: PAS) ו מראש דוקטורט NIH NRSA מלגת הרשות הפלסטינית (F31AA017042) מן המכון הלאומי על אלכוהול ו אלכוהוליזם. GIRK2-L257W מוטציה סופק על ידי ד"ר Prafulla Aryal.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי חסות ובתנאי בחביבות על ידי מכשירים לייקה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | Sigma | Varies | |
| Mini Prep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Radiacwash | Biodex | 005-100 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | BD Biosciences | CB40210 | Poly-L-lysine can also be used |
| Maxi Prep Kit | Qiagen | 12263 | |
| QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit | Stratagene | 200512-5 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Cover slips ˆ… 12 mm | Warner Instruments | CS-12R | |
| Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall | Warner Instruments | G150-3 | |
| Inverted fluorescence microscope |  Leica |
DMI3000 B | |
| Electrophysiology | Nikon/ Leica/ Zeiss |
Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence |
|
| Amplifier | Molecular Devices | Axon Axopatch 200B amplifier | |
| Perfusion system | Warner Instruments | VC-6 Perfusion MM-6 | |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1320 digitizer | |
| Manipulators | Sutter Instruments | Manipulator: MP-85 | |
| Electrode Puller | Narishige | PC10 vertical electrode puller | |
| Isolation Table | Technical Manufacturing Corporation | Air table |
References
- Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation. Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).
- Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis. J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).
- Doyle, D. A., Cabral, M. orais, Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &, B. T., MacKinnon, R. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science. 280, 69-77 (1998).
- Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera. EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).
- Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 Å resolution. Science. 326, 1668-1674 (2009).
