Summary
हम कैसे एक आयन चैनल के समारोह पर एक एकल बिंदु उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रदर्शन करेंगे.
Abstract
हम कैसे एक आयन चैनल में एक बिंदु उत्परिवर्तन शुरू करने की कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रदर्शन करेंगे. हम जी प्रोटीन-gated भीतर सुधार (GIRK के रूप में संदर्भित) पोटेशियम चैनलों, जो न्यूरॉन्स के excitability के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं अध्ययन. वहाँ चार अलग अलग स्तनधारी GIRK चैनल सब यूनिटों (GIRK1 GIRK4) कर रहे हैं - हम GIRK2 पर ध्यान केंद्रित है क्योंकि यह एक homotetramer रूपों. जी प्रोटीन युग्मित (GPCRs) जैसे muscarinic रिसेप्टर (M2R), रिसेप्टर्स, के विभिन्न प्रकार की उत्तेजना GIRK चैनलों के सक्रियण के लिए होता है. शराब भी सीधे GIRK चैनल सक्रिय. हम दिखा देंगे कि कैसे सीडीएनए में GIRK चैनल के लिए विशेष रूप से एक या एक से अधिक nucleotides बदलने के द्वारा एक एमिनो एसिड रूप बदलना करने के लिए. यह उत्परिवर्तित सीडीएनए अनुक्रम बैक्टीरिया में परिलक्षित हो जाएगा, शुद्ध, और बिंदु उत्परिवर्तन की उपस्थिति डीएनए अनुक्रमण द्वारा की पुष्टि की जाएगी. उत्परिवर्तित और जंगली प्रकार GIRK चैनलों के लिए cDNAs मानव भ्रूण गुर्दे HEK293T इन विट्रो में संवर्धित कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया जाएगा. अंत में, पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी ectopically व्यक्त जंगली प्रकार या उत्परिवर्तित GIRK चैनलों के माध्यम से macroscopic पोटेशियम धाराओं का अध्ययन किया जाएगा. इस प्रयोग में, हम M2R निर्भर है और शराब पर निर्भर सक्रियण पर GIRK2 चैनल में एक L257W उत्परिवर्तन के प्रभाव की जांच करेंगे.
Protocol
1. साइट mutagenesis निर्देशित
हम स्तनधारी अभिव्यक्ति प्लाज्मिड pcDNA3.1 एन्कोडिंग GIRK2 के लिए एक सीडीएनए का उपयोग करें और एक बिंदु Stratagene Quikchange (Agilent टेक्नोलॉजीज) एक्स्ट्रा लार्ज साइट निर्देशित द्वितीय mutagenesis के किट का उपयोग कर, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, उत्परिवर्तन परिचय.
प्राइमर्स अनुक्रम आसानी से ऑनलाइन प्राइमर पर उपलब्ध डिजाइन कार्यक्रम का उपयोग करते हुए उत्पन्न कर सकते हैं:
https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15
नोट: हम बी.डी. 14 एमएल प्रोटोकॉल में वर्णित ट्यूबों की जगह में मानक Eppendorf 1.5 एमएल ट्यूबों का उपयोग करें. हालांकि, XL10 - गोल्ड ultracompetent ई. का उपयोग β-mercaptoethanol साथ pretreated कोलाई, 30s गर्मी झटका समय और NZY + (या NZYM +) मीडिया सफल mutagenesis के लिए महत्वपूर्ण हैं. यदि संभव हो तो, एक अतिरिक्त मूक उत्परिवर्तन है कि एक नए प्रतिबंध साइट बनाता इंजीनियरिंग उत्परिवर्ती कालोनियों के नीचे स्क्रीनिंग के लिए सुविधाजनक हो सकता है.
2. Miniprep, डीएनए अनुक्रमण और Maxiprep
2.1 Qiagen miniprep और अनुक्रमण.
व्यक्तिगत बैक्टीरियल कालोनियों को उठाया और एम्पीसिलीन (एएमपी) के साथ लेग शोरबा में हो. हम सीडीएनए सफ़ाई के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें. एक साधारण प्रतिबंध पचाने में उत्परिवर्तन के सफल परिचय पुष्टि के लिए किया जा सकता है, अगर प्रतिबंध साइट ऊपर चरण 1 में शामिल है. स्वचालित डीएनए अनुक्रमण परोक्ष किया जाता है, और सीडीएनए में उत्परिवर्तन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में आकलन है कि वहाँ किसी भी अवांछित म्यूटेशनों हैं. यह कदम बहुत महत्वपूर्ण है. हम पूरे GIRK कोडन आगे T7 प्रमोटर और रिवर्स BGH अनुक्रमण प्राइमरों का उपयोग कर अनुक्रम अनुक्रम है कि पार्श्व pcDNA3.1 प्लाज्मिड के कई क्लोनिंग साइट.
नोट: यह महत्वपूर्ण है ध्यान से अनुक्रमण करने के लिए अनुक्रमण डेटा की पर्याप्त गुणवत्ता आश्वासन electropherogram का निरीक्षण. उच्च गुणवत्ता electropherogram तेज, छोटे पृष्ठभूमि शोर के साथ गैर अतिव्यापी चोटियों है.
2.2 Qiagen maxiprep.
हम निर्माता के निर्देशों का पालन करें.
नोट: यह कदम हमारे प्रयोगों में शामिल है सीडीएनए की शुद्धता, जो हम पाते हैं कुशल अभिकर्मक के लिए महत्वपूर्ण है में सुधार.
3. संस्कृति और HEK293T प्रकोष्ठों के अभिकर्मक
इन चरणों के सभी एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में किया जाना चाहिए.
3.1 सेल संस्कृति
HEK293T कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक हैं क्योंकि वे संस्कृति के लिए आसान कर रहे हैं (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर), तेजी से प्रतिकृति समय, उच्च अभिकर्मक दक्षता है और पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी करने के लिए उत्तरदायी हैं. HEK293T कोशिकाओं SV40 बड़ी टी प्रतिजन है कि pcDNA3.1 प्लाज्मिड के episomal प्रतिकृति सुनिश्चित व्यक्त करते हैं.
HEK293T कोशिकाओं को कम ग्लूकोज DMEM एल glutamine के साथ पूरक मीडिया और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) में सभ्य हैं. Passaging कोशिकाओं के लिए, 0.25% / trypsin EDTA (90-95%) मिला हुआ HEK293T कोशिकाओं को जोड़ने के लिए, रुको जब तक कोशिकाओं ऊतक पकवान से अलग है, तो ताजा FBS / युक्त मीडिया के अलावा द्वारा एंजाइम गतिविधि को रोकने के. प्लेट ~ 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति डिश में एंटीबायोटिक मुक्त संस्कृति के प्रति में अच्छी तरह से मीडिया के 1 एमएल के साथ साथ. (1 एक्स 10 5 कोशिकाओं ~ सेल निलंबन के 350 μL मिला हुआ T25 10 एमएल मीडिया के साथ resuspended कुप्पी से प्राप्त है).
3.2 अभिकर्मक
8-24 बजे के बाद, HEK कोशिकाओं प्लास्टिक पालन करना और अभिकर्मक के लिए तैयार हैं. 0.2 μg सीडीएनए चैनल, 0.4 μg सीडीएनए रिसेप्टर और 0.04 M2R μg सीडीएनए YFP Invitrogen Lipofectamine 2000 का उपयोग कर के साथ transfect कोशिकाओं. नोट: हम YFP सीडीएनए की एक छोटी राशि निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं जो सफलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट (हरी कोशिकाओं की संभावना दोनों GIRK चैनलों और M2 रिसेप्टर्स शामिल होंगे) का उपयोग करें. उपयोग करने के लिए सीडीएनए की एकाग्रता प्रत्येक क्लोन के लिए समायोजित किया जा आवश्यकता होगी.
3.3 ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति दृश्य.
एक औंधा प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के मंच पर प्लेस 12-अच्छी तरह से थाली, और YFP अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं की जांच. डीआईसी छवि की तुलना में और हरी कोशिकाओं की अनुमानित संख्या के नोट बनाने. यह अभिकर्मक दक्षता के एक अनुमान प्रदान करता है.
24 अच्छी तरह से बर्तन और पाली - डी lysine लेपित कवर फिसल जाता है की 3.4 तैयार
उन्हें मिलाते हुए Radiacwash के साथ रात भर, विआयनीकृत जल से धोने और रात में 95% इथेनॉल में मिलाते द्वारा बाद से 12 मिमी कांच कवर फिसल जाता है (वार्नर, CS-12R) साफ करें. उपयोग करें जब तक 70% इथेनॉल में स्टोर स्वच्छ कवर फिसल जाता है.
इथेनॉल के साथ एक पेट्री डिश, इथेनॉल बंद लौ संदंश और बर्नर का उपयोग कर, एक प्लेस में कवर फिसल जाता हैघ में अच्छी तरह से एक बाँझ 24 अच्छी तरह से थाली के एक जगह है.
पाली-D-lysine के 250 μL (PDL) समाधान के साथ हर अच्छी तरह से कवर [0.2 मिलीग्राम / एमएल] और दो कवर फिसल जाता है रातोंरात बाँझ हुड के तहत PDL समाधान में डूब कर बैठते हैं. लपेटें Parafilm में 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए वाष्पीकरण से बचने के के लिए.
अगली सुबह, PDL aspirate और बाँझ पानी के साथ 2x धोने. प्लेटों के हुड के नीचे सूखी खोलते हैं, तो कवर छोड़ दें. 24 लेपित कवर फिसल जाता है के साथ अच्छी तरह से व्यंजन बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी के साथ में लिपटे कर सकते हैं और हफ्तों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत.
कवर पर 3.5 चढ़ाना ट्रांसफ़ेक्ट HEK293T कोशिकाओं फिसल जाता है
24 घंटों के बाद 24 अच्छी तरह से पकवान (~ 4 एक्स 10 3 कोशिकाओं को अच्छी तरह /) में अभिकर्मक, विभाजन, कोशिकाओं गिलास को कवर युक्त पाली - डी - lysine साथ लेपित निकल जाता है. नोट: ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं 24-72 बजे पोस्ट अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कोशिकाओं पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोग के लिए अलग - अलग कवर फिसल जाता है प्रदान करने के लिए विभाजित कर रहे हैं.
4. इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी
4.1 तैयारी समाधान
कोशिकी समाधान (स्नान), 20 मिमी KCl, 140 मिमी NaCl, 0.5 मिमी 2 CaCl, 2 मिमी 2 MgCl और 10 मिमी HEPES (NaOH साथ पीएच 7.4 सेट) .
विभाज्य 20K स्नान समाधान और उचित modulators जोड़ें
- 20K + 2 बा: 1 मिमी 2 BaCl युक्त समाधान: आवक सुधार धाराओं के एक विशिष्ट अवरोध करनेवाला
- 20K + Carbachol: 5 सुक्ष्ममापी Carbachol के साथ समाधान: एक विशिष्ट M2R agonist, M2R जोड़ों कि जी प्रोटीन के लिए खुला चैनल GIRK
- 20K + इथेनॉल: स्नान 100 मिमी EtOH युक्त GIRK चैनलों को सीधे सक्रिय समाधान
तेजी से आदान - प्रदान छिड़काव प्रणाली के सीरिंज (समाधान कंटेनर) में रखें स्नान समाधान. नोट: हम एक वार्नर चुटकी वाल्व प्रणाली का उपयोग करने के लिए स्नान समाधान नियंत्रण. पीई टयूबिंग की सिफारिश की है.
आंतरिक इलेक्ट्रोड / समाधान: 140 मिमी KCl, 20 मिमी NaCl, 5 मिमी EGTA, 5.4 मिमी MgCl 2, 10 मिमी 2.5 मिमी कश्मीर एटीपी 2 और 0.3 ली 2 GTP सुक्ष्ममापी साथ HEPES (7.4 पीएच).
हम एटीपी और GTP बिना इलेक्ट्रोड समाधान बनाते हैं. हम अलग - अलग एटीपी और GTP की aliquots, जो -80 ° सी में संग्रहीत हैं तैयार है, और प्रयोग के दिन पर इलेक्ट्रोड समाधान के लिए जोड़ें. हम बर्फ पर अंतिम इलेक्ट्रोड समाधान के लिए एटीपी / GTP के संरक्षण के साथ सिरिंज रहते हैं. हम बाँझ फ़िल्टर आंतरिक / बाहरी समाधान माइक्रोबियल विकास को बाधित करने के लिए और ट्यूब clogging की संभावना है और इलेक्ट्रोड कम (0.2 सुक्ष्ममापी).
4.2 पुलिंग इलेक्ट्रोड
हम Narishige दो कदम ऊर्ध्वाधर खींचने और वार्नर साधन (1.5 मिमी बाहरी व्यास, 0.86 मिमी भीतरी व्यास 7.5 सेमी लंबाई) से borosilicate ग्लास इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए प्रतिरोध के MΩ 3-7 जब intracellular समाधान के साथ भर के साथ इलेक्ट्रोड प्राप्त.
नोट: यह आवश्यक है करने के लिए प्रयोगात्मक इलेक्ट्रोड और अपनी प्रयोगशाला में इलेक्ट्रोड कांच के प्रकार खींचने के लिए मानदंड तय है. हमारे ऊर्ध्वाधर खींचने के लिए, हम पहले और दूसरा पुल के लिए पुल 43 ~ के लिए 60.2 के एक गर्मी की स्थापना का उपयोग करें.
4.3 पूरे सेल clamping पैच
- माउंट वेसिलीन की छोटी राशि का उपयोग एक 35 मिमी डिश में पर्ची कवर, बाहरी और समाधान के साथ एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के मंच पर जगह पकवान कवर. ध्यान केंद्रित करने और कोशिकाओं को खोजने के डीआईसी का प्रयोग करें, प्रतिदीप्ति YFP YFP सकारात्मक कोशिकाओं का पता लगाने स्विच.
- एक हरे रंग की सेल (ब्याज = 2-3 सेल अलग लंबाई की सेल से 20-30 सुक्ष्ममापी) के पास कई गुना छिड़काव की स्थिति टिप.
- 1 लाभ, विन्यास:: पूरे सेल β = 1, मोड वी दबाना समाधान के साथ इलेक्ट्रोड भरें निम्नलिखित प्रारंभिक सेटिंग्स के साथ Axopatch 200B एम्पलीफायर के headstage (Axon उपकरण) के लिए यह देते हैं.
- विंदुक के clogging रोकने के लिए, और जोड़तोड़ का उपयोग करने के लिए सेल के ऊपर सिर्फ इलेक्ट्रोड टिप जगह इलेक्ट्रोड पर सकारात्मक दबाव लागू करें.
- विंदुक संभावित शून्य करने के लिए, सील टेस्ट एक परीक्षण वोल्टेज कदम देने के लिए बटन का चयन करें. 5 mV आयताकार वोल्टेज कदम Clampex की सील टेस्ट विंडो में दिखाई देगा. एम्पलीफायर पर पिपेट ऑफसेट तनाव नापने का यंत्र को समायोजित करने के लिए 0 NA करने के लिए मौजूदा बेस लाइन लाने के लिए. वैकल्पिक रूप से, प्रवर्धक वी ट्रैक मोड और मीटर घुंडी Vtrack और प्रवर्धक पर पिपेट ऑफसेट तनाव नापने का यंत्र का उपयोग करने के लिए प्रवर्धक मीटर "0.00" प्रदर्शित करने पर वोल्टेज लाने के लिए चयनकर्ता मोड स्विचन द्वारा विंदुक संभावित शून्य.
- सील Clampex 8.2 सॉफ्टवेयर (07/03 MΩ होना चाहिए) के परीक्षण के आदेश का उपयोग इलेक्ट्रोड के प्रतिरोध की जाँच करें.
- एक बचाया प्रोटोकॉल फ़ाइल खोलें या एक नया प्रोटोकॉल बनाने. प्रोटोकॉल फ़ाइल खोलने के लिए चयन मुख्य मेनू से तब खोलें प्रोटोकॉल मोल और एक बचाया वोल्टेज प्रोटोकॉल फ़ाइल चुनें. इस प्रयोग के लिए प्रोटोकॉल के 40mV में झिल्ली संभावित पकड़ -100 एम वी और रैंप के लिए 2 से अधिक 40 mV एक एकल 50 एमएस वोल्टेज कदम देने के लिए बनाया गया है00 एमएस. इस प्रोटोकॉल हर 2 सेकंड मार डाला है. रैंप प्रोटोकॉल GIRK चैनलों की क्षमता और आवक परिहार उत्क्रमण के अवलोकन के लिए अनुमति देता है. वोल्टेज-gated आयन चैनलों के लिए, एक आयताकार वोल्टेज कदम अधिक उपयुक्त हो सकता है.
- दृष्टिकोण सेल जोड़तोड़ के ठीक समायोजन का उपयोग, सकारात्मक दबाव जारी, कोशिका की सतह को छूने के बाद नकारात्मक दबाव लागू करने के लिए, और प्रतिरोध में सील टेस्ट आस्टसीलस्कप विंडो में वृद्धि की निगरानी. एक बार प्रतिरोध GΩ रेंज में है, इलेक्ट्रोड झिल्ली (Gigaseal का गठन किया है) पर बंद है.
- कोशिका झिल्ली को तोड़ने और सेल में पहुँच प्राप्त करने के लिए नकारात्मक दबाव के एक पल्स लागू करें. पूरे सेल विन्यास में एक बार, तुम capacitive धाराओं को पंजीकृत करने के लिए बढ़ जाएगा.
- Clampex में झिल्ली टेस्ट के लिए स्विच और नीचे का उपयोग प्रतिरोध रा, झिल्ली प्रतिरोध rm, झिल्ली समाई सेमी लिखने और असली capacitative वर्तमान करने के लिए सैद्धांतिक वक्र के घातीय फिट आँख द्वारा सत्यापित. झिल्ली समाई कोशिका का आकार करने के लिए आनुपातिक है और बाद में इस्तेमाल किया जाएगा वर्तमान घनत्व की गणना.
- वापस स्विच करने के लिए 10 kHz पर टेस्ट -40 एम वी और फिल्टर करने के लिए वी आउट (झिल्ली संभावित) की स्थापना की सील
- निम्न चरणों के साथ झिल्ली और प्रवर्धक पर श्रृंखला प्रतिरोध समाई के लिए क्षतिपूर्ति:
- पूरे सेल कैप पर स्विच स्विच करें. पूरे सेल कैप और श्रृंखला प्रतिरोध डायल आगे और पीछे से समायोजित, जब तक आप एक फ्लैट परीक्षण पल्स मिलता है. तुम भी विंदुक समाई फास्ट कैप घुंडी समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है.
- % भविष्यवाणी घुंडी पर 60-80% के बारे में करने के लिए मुड़ें, फिर से पुनः समायोजन पूरे सेल कैप और श्रृंखला प्रतिरोध डायल (आप विंदुक समाई मुआवजा फास्ट कैप घुंडी के रूप में अच्छी तरह से समायोजित हो सकता है).
- सेल oscillating बिना COMP% 100% पर मुड़ें, जबकि पुनः समायोजन पूरे सेल कैप और श्रृंखला प्रतिरोध (आप विंदुक समाई मुआवजा फास्ट कैप घुंडी के रूप में अच्छी तरह से समायोजित हो सकता है) द्वारा फ्लैट पल्स रखने की कोशिश कर रहा है. समय को लगातार कम करने के द्वारा अंतराल समायोजित करें.
- नीचे (झिल्ली समाई) सेमी, रुपये (श्रृंखला प्रतिरोध),% COMP के लिए मान लिखें,% pred और अंतराल समय नोटबुक में एम्पलीफायर पर सेट. सेमी रुपये और लगभग सेमी और Rm ऊपर झिल्ली टेस्ट में मापा के रूप में एक ही होना चाहिए.
- स्नान समाधान को नियंत्रित करने के लिए बाह्य समाधान वाल्व पर मुड़ें. 2kHz के लिए प्रवर्धक 8 पोल बेसल फ़िल्टर सेट, एक वोल्टेज क्लैंप प्रोटोकॉल खुला और रिकॉर्डिंग धाराओं शुरू.
- हम रिकॉर्ड GIRK धाराओं का उपयोग कर एक रैंप प्रोटोकॉल है कि एमएस 50 100 mV से 200 एमएस से अधिक 40 mV तो रैंप के लिए -100 एम वी के लिए कदम है और हर 2 सेकंड दिया. रैंप प्रोटोकॉल उत्क्रमण क्षमता के अवलोकन के लिए और GIRK चैनलों की आवक परिहार संपत्ति के लिए अनुमति देता है. कमरे के तापमान पर (22-25 डिग्री सेल्सियस), वर्तमान GIRK पास -50 एम वी (स्नान में 20 मिमी KCl के साथ) है, जो कश्मीर (कश्मीर ई = एम वी -50) के लिए गणना संतुलन संभावित के पास है रिवर्स चाहिए, तो रहना ई कश्मीर सकारात्मक क्षमता पर काफी फ्लैट.
- प्रायोगिक प्रोटोकॉल: एक स्थिर आधारभूत रिकॉर्डिंग के बाद, 20K + Carbachol समाधान के लिए स्विच और प्रतिक्रिया के शिखर के लिए प्रतीक्षा, 20K स्नान समाधान करने के लिए वापस स्विच, तो 20K + इथेनॉल लागू करते हैं और पीक प्रतिक्रिया के लिए प्रतीक्षा करने के लिए, तो 20K स्नान समाधान करने के लिए स्विच, और अंत में 20K + 2 बा + समाधान. इन दवाओं के आवेदन के दौरान आप GIRK धाराओं (सबसे -100 mV में स्पष्ट) के आयाम में परिवर्तन देखेंगे. नोटबुक में विभिन्न कोशिकी समाधान के आवेदन करने के लिए इसी का पता लगाने संख्या नोट करें. एक एकल Clampfit फ़ाइल पूरे प्रयोग के लिए sweeps के सभी शामिल होंगे.
5. डेटा विश्लेषण
हम Clampfit 9.2 सॉफ्टवेयर का उपयोग -100 एम वी पर डेटा GIRK धाराओं का विश्लेषण.
- रिकॉर्डिंग के साथ फ़ाइल खोलें, -100 एम वी पर कर्सर सेट. डिफ़ॉल्ट रूप से आप सभी स्क्रीन पर मढ़ा निशान देखेंगे. "कर्सर लिखें" आइकन का उपयोग करके आप संख्यात्मक डेटा के साथ Excel को जैसे स्प्रेडशीट पैदा करेगा.
- बताए एक्स ट्रेस संख्या स्तंभ और कर्सर स्तंभ के लिए वाई के लिए और "ग्राफ़ बनाएँ" आइकन में तुम जल्दी से प्रयोग के समय पाठ्यक्रम की साजिश आकर्षित कर सकते हैं दबाने.
- बाहरी छिड़काव अकेले समाधान ("20K वर्तमान" शून्य "+ 20K 2 बा वर्तमान +") में दर्ज वर्तमान + 2 बा की उपस्थिति में वर्तमान subtracting द्वारा बेसल वर्तमान गणना. 20K में सक्रिय धाराओं से बेसल वर्तमान subtracting द्वारा प्रेरित धाराओं की गणना ("20K + Carbachol वर्तमान" शून्य "वर्तमान 20K"; "20K + इथेनॉल वर्तमान" शून्य "20K वर्तमान"). वर्तमान झिल्ली समाई (सीधे एम्पलीफायर से पढ़ा) से विभाजित करके वर्तमान घनत्व (PA / पीएफ) की गणना. बेसल धाराओं से प्रेरित धाराओं को विभाजित करने और 100 से गुणा करके सक्रियण प्रतिशत की गणना.
6. प्रतिनिधि परिणाम
तुम जंगली प्रकार के चैनलों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से वर्तमान रिकॉर्ड करने में सक्षम होना चाहिए. GIRK चैनलों उपाय के लिएकोशिकी 20 मिमी युक्त समाधान में घ + K (और 145 + K intracellular मिमी) वे मजबूत आवक परिहार और ~ -50 mV, जो पोटेशियम चैनलों की एक आवश्यक गुण है की एक उलट संभावित प्रदर्शन करना चाहिए . जंगली - प्रकार वर्तमान carbachol आवेदन (3-5 बेसल वर्तमान गुना वृद्धि पर) पर दृढ़ता बढ़ाने के लिए और 100 मिमी के इथेनॉल के लिए इसी तरह जवाब देंगे. नोट: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए पर हस्ताक्षर सम्मेलन आवक वर्तमान नकारात्मक है और जावक वर्तमान सकारात्मक है कि. GIRK2 की शराब बाध्य जेब में L257W उत्परिवर्तन के लिए, आप तनु प्रतिक्रियाओं दोनों carbachol और इथेनॉल के लिए देखेंगे. यह पता चलता है कि L257 शराब और जी GIRK2 चैनलों के प्रोटीन सक्रियण में शामिल है. GIRK2 mutagenesis के परिणामों के आगे उदाहरण के लिए, Aryal एट अल द्वारा हाल के प्रकाशन को देखने के 1..
चित्रा 1. Clampfit 8.0 से पता चलता है डेटा फ़ाइल के जंगली प्रकार GIRK2 रिकॉर्डिंग के लिए विंडो. ऊपरी बाईं पैनल से पता चलता है कि आरोपित अलग बाह बाहरी समाधान की उपस्थिति में एक रैंप वोल्टेज प्रोटोकॉल के जवाब में दर्ज sweeps. 1 कर्सर -100 एम वी पर तैनात है. कर्सर मान स्प्रेडशीट (राइट पैनल) के लिए लिखा जाता है. लोअर बाईं पैनल झाडू संख्या बनाम, वर्तमान की साजिश से पता चलता है. (EtOH) इथेनॉल और carbachol (Carb) और 2 बा + के साथ वर्तमान निषेध के साथ वर्तमान में वृद्धि (नीचे विक्षेपन) नोट.
चित्रा 2. Clampfit एक उत्परिवर्ती GIRK2-L257W रिकॉर्डिंग के लिए 8.0 से पता चलता है डेटा फ़ाइल की खिड़की. वर्णन चित्रा 1 के रूप में वही कर रहे हैं . Carbachol (Carb) सक्रियण और उत्परिवर्ती चैनलों में EtOH प्रेरित धाराओं की कमी के नुकसान पर ध्यान दें.
Discussion
साइट - निर्देशित mutagenesis आयन चैनलों की संरचना समारोह रिश्तों का अध्ययन करने के लिए एक शास्त्रीय दृष्टिकोण है. यह आधार है कि आयन चैनल के एक महत्वपूर्ण अवशेषों बदलकर एक चैनल के समारोह में स्पष्ट परिवर्तन देखने में सक्षम होना चाहिए पर आधारित है. इसके विपरीत, गैर गंभीर स्थिति में कई परिवर्तन चैनल के समारोह के लिए प्रमुख perturbations के बिना शुरू किया जा सकता है है. आमतौर पर, पहले प्रश्न में अवशेषों alanine, एक छोटे गैर ध्रुवीय एमिनो एसिड tryptophan, एमिनो एसिड की सबसे बड़ी 2 उत्परिवर्तन के बाद mutated है . यदि अवशेषों चैनल के समारोह के लिए महत्वपूर्ण है, दोनों म्यूटेशनों चैनल गतिविधि बदल जाएगा. यदि एक कम आवश्यक अवशेषों mutated है, उत्परिवर्तन, विशेष रूप से alanine के प्रभाव अक्सर unremarkable. Tryptophan म्यूटेशनों अधिक tryptophan के आकार के साथ जुड़े steric बाधा के कारण परिवर्तन के कारण होने की संभावना हैं. अक्सर, जब संरचनात्मक जानकारी की कमी है, चैनल (alanine या tryptophan स्कैन कहा जाता है) का एक टुकड़ा के भीतर alanine या tryptophan करने के लिए व्यवस्थित उत्परिवर्तन महत्वपूर्ण अवशेषों का पता लगाने में इस्तेमाल किया जा सकता है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि अलग बिंदु उत्परिवर्तन के साथ कई क्लोनों समानांतर अपेक्षाकृत कम समय के भीतर एकाधिक अवशेष परीक्षण के लिए अनुमति में तैयार किया जा सकता है. हाल ही में, कई चैनलों के क्रिस्टल संरचनाओं उपलब्ध हो गए हैं 3,4,5. वे संभावित प्रमुख करने के लिए इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर परीक्षण किया अवशेषों का प्रस्ताव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
जंगली प्रकार के चैनल पर माप हमेशा एक उत्परिवर्ती चैनल को विश्वास दिलाता हूं कि अभिकर्मक और electrophysiological प्रयोगों सही ढंग से किया गया एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा की माप के साथ करना चाहिए. प्वाइंट म्यूटेशनों एक कार्यात्मक वर्तमान की कमी, एक मौजूदा चैनल गतिविधि के जंगली प्रकार या बदल विनियमन के लिए इसी तरह करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. औसत दर्जे का वर्तमान के अभाव अनुचित तह या बदल तस्करी की वजह से हो सकता है. ऐसी स्थिति में यह उपयोगी हो सकता है पता लगाने के लिए कि क्या चैनल biotinylation परख या बाह्य टैग खिलाफ immunofluorescence धुंधला (सेल permeabilization बिना) के प्लाज्मा झिल्ली और सेल के अंदर बनाए रखा चैनलों पर गैर कार्यात्मक चैनलों के बीच भेद का उपयोग कर सतह के लिए सही ढंग से traffics है . अंत में, यह न केवल लेकिन यह भी चैनल चैनल विनियमन पर उत्परिवर्तन के परिणाम के बेसल गतिविधि की जांच उचित है. चैनल समारोह के मॉडुलन के विभिन्न तंत्र जी प्रोटीन, PIP2, आयनों, एटीपी एकाग्रता, phosphorylation (tyrosine, सेरीन या threonine उत्परिवर्तन का उपयोग करके), ubiquitination या sumoylation (lysine उत्परिवर्तन का उपयोग करके) द्वारा विनियमन सहित हित के आयन चैनल के आधार पर अध्ययन किया जा सकता और प्रत्यक्ष चैनल सलामी बल्लेबाज या ब्लॉकर्स.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
और एक पूर्व डॉक्टरेट NIH एनआरएसए पीए फेलोशिप (F31AA017042) शराब सेवन पर राष्ट्रीय संस्थान से, हमारा काम न्यूरोसाइंस (पीए), नशीली दवाओं के सेवन पर राष्ट्रीय संस्थान (पीए R01 DA019022) के लिए McKnight बंदोबस्ती कोष से वित्तीय सहायता के द्वारा संभव बनाया गया था और शराब. उत्परिवर्ती GIRK2-L257W डॉ. प्रफुल्ल Aryal द्वारा प्रदान की गई थी.
प्रतिदीप्ति खुर्दबीन और प्रायोजन कृपया Leica उपकरण द्वारा प्रदान की गई है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | Sigma | Varies | |
| Mini Prep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Radiacwash | Biodex | 005-100 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | BD Biosciences | CB40210 | Poly-L-lysine can also be used |
| Maxi Prep Kit | Qiagen | 12263 | |
| QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit | Stratagene | 200512-5 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Cover slips ˆ… 12 mm | Warner Instruments | CS-12R | |
| Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall | Warner Instruments | G150-3 | |
| Inverted fluorescence microscope |  Leica |
DMI3000 B | |
| Electrophysiology | Nikon/ Leica/ Zeiss |
Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence |
|
| Amplifier | Molecular Devices | Axon Axopatch 200B amplifier | |
| Perfusion system | Warner Instruments | VC-6 Perfusion MM-6 | |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1320 digitizer | |
| Manipulators | Sutter Instruments | Manipulator: MP-85 | |
| Electrode Puller | Narishige | PC10 vertical electrode puller | |
| Isolation Table | Technical Manufacturing Corporation | Air table |
References
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