트렌스 제닉 모기를 구하는 A. aegypti의 태아의 Microinjection

Summary

이 비디오에서는 Nijole Jasinskiene는 뎅그열 발열에 대한 벡터 아르 유전자 변형 Aedes aegypti 모기를 생성하기 위해 사용된 방법을 보여줍니다. 정확하게, microinjection의 바늘을 준비하는 배아를 d​​essicating, 그리고 microinjection을 수행하기위한 기술은 증명됩니다.

Abstract

이 비디오에서는 Nijole Jasinskiene는 뎅그열 발열에 대한 벡터 아르 유전자 변형 Aedes aegypti 모기를 생성하기 위해 사용된 방법을 보여줍니다. 정확하게, microinjection의 바늘을 준비하는 배아를 d​​essicating, 그리고 microinjection을 수행하기위한 기술은 증명됩니다.

Protocol

microinjection 사전에 준비

1. 혈액 공급 모기 : 월요일부터 목요일 이전 금요일 공급 여자에 분사하십시오.
2. 프로그램 3 2 (자료 참조)를 사용하여 유리 바늘을 준비합니다.
3. 배아의 튜브를 누워있는 것은 Drosophila 문화 약병입니다. 그것을 다루는 필터 종이 젖은 디스크와 함께 바닥에 젖은 탈지면.
4. 권력을 더블 사이드 테이프를 대고 비닐 커버 신청서를 준비합니다. 그것이 커버 슬립의 가장자리에 끝이 너무 커버하는 트림 테이프 이구요.
5. (자료 참조) 건조를 위해 기름을 준비
6. 주사 후 배아를 유지하는 여과지 (80mm 왓먼)의 젖은 디스크로 덮인 바닥에 젖은 탈지면, 150 ML 플라스틱 비이커.

강제 부설의 설정

1. 흡인기를 이용하여 6-10 혈액 공급의 여자를 수집하고 서부 유럽 표준시 면화 및 필터 종이 Drosophila 문화 병을에게 전송할 수 있습니다.
2. 어둠 속에서 insectory 조건으로 다시 모기를 넣고 1 시간 및 15에 대한 알을 낳을 수 있습니다.
3. 성인 케이지로 비행하고 태아와 여과지 디스크를 제거하자.
4. 해부 현미경, 그래서 계란을 줄을 수 있습니다. 좋은 포셉 번호 5 벌금 페인트를 사용 darkish - 회색 배아에 회색 선택하고 물에 젖었 3MM 왓먼 용지의 광장에 일렬로 배열. 주사는 후부 기둥에 갈 수있는 것처럼 모든 배아가 같은 방향에 있어야합니다. 배아의 앞쪽에 끝이 뒷부분보다 약간 넓은 있습니다. (서부 유럽 표준시 것들이 테이프에 붙어되지 않습니다) 그것에 건조 여과지를 눌러 태아와 필터 종이를 건조시킵니다. , 계란을 전송 양면 테이프가 들어있는 슬라이드를 반전하고 부드럽게 달걀에 대한 키를 누릅니다. 계란의 뒷부분 끝 이중 양면 테이프의 가장자리에 아주 가까이해야합니다.
5. 1 분에 대한 배아를 마르다. 상온에서. 그들은 드라이로 그들은 약간 보조개로 시작합니다.
6. 더 탈수를 방지하기 위해 할로 카본 오일 desiccated 배아를 커버.

배아의 Microinjection

1. 좋은 주입의 가장 중요한 부분은 (자료 참조) 바늘의 품질입니다.
2. microloader를 사용하여 주입하는 DNA 솔루션 바늘을 입력합니다. 거의 사출 솔루션이 필요합니다 : 1-2 μl합니다.
3. 사출 시간 (마누)과 압력 (600)를 제어 Transjector, 그리고 backpressure (250)에 바늘을 연결합니다. Microinjection은 X 10 배율과 micromanipulator에서 이동 무대 (Leica)와 현미경을 사용하여 수행됩니다. 필요한 경우, 제기 현미경 스테이지 4-5 현미경 슬라이드를 스태킹하여 준비 수 있습니다. 제기 무대에 배아를 가지고 커버 전표를 놓습니다. endochorion의 끊어지고 방지하기 위해 수평으로 배아를 주입, 보급률은 사후 극에서해야합니다. 주사, 그 바늘이 고정 유지하고 현미경의 단계로 이동합니다.
4. 배아 볼륨의 약 1-5%에 해당 솔루션의 0.2-0.5 NL을 주사. 사출 압력 및 시간을 조정하여 사출 볼륨을 제어합니다. 약간 숙이고, desiccated 배아들은 과장된 외관의 다음과 같은 사출을 회복해야합니다.
5. 벌금 포셉 또는 좋은 브러시를 사용하여 커버 슬립의 배아를 선택하고, 서부 유럽 표준시 면화으로 젖은 필터 종이와 플라스틱 비커에 넣습니다. 조직 종이로 비커를 커버. 테두리 탄성 밴드와 장소에 보관하고 4 일간 insectary 조건으로 돌아갑니다.

포스트 - 사출

1. 나흘 후, 음식의 작은 양의 큰 플라스틱 상자에 물을 조심스럽게 장소 배아 종이, 아래 배아 측. 배아는 매우 긴 기간 동안 부화 : 최소한 4-5주 사후 분사까지 문화를 던져하지 않습니다.

노트

주사에 대한 DNA

주사에 대한 플라스미드 DNA 솔루션은 EndoFree 플라스미드 키트를 사용하여 격리되었다. 구축 및 오른쪽 농도 함께 도우미 플라스미드 믹스, izopropanol 함께 시켰던. 펠렛은 사출 버퍼 resuspending하기 전에 70 % 에탄올로 씻은했다. 전에 주입, Millex - GV 칼럼을 사용하여 청소 DNA.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x Injection solution	Buffer			5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Construct plasmid	DNA			0.5 mg/ml.
Helper plasmid	DNA			0.3 mg/ml
EndoFree Plasmid kit	Kit	Qiagen
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	To clean DNA.
Glass puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-87	Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50
Quartz puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-2000	Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
Injection glass needles				Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument).
Aedes aegypti	Animal			Male and female mosquitos, to obtain embryos.
Drosophila culture vial				For mosquito egg-laying.
Halocarbon oil	Reagent			Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1)
Forceps No5	Tool
Fine paintbrush		Kolinsky Sable	No. 0000
Whatman paper	Tool
Microloader	Tool	Eppendorf	5242 956.003
Transjector	Tool	Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		With moving stage and micromanipulator.
3MM Whatman paper
double sided tape