Summary
在这个视频,Nijole Jasinskiene演示方法生成的转基因埃及伊蚊蚊子,登革热的病媒。正确准备显微注射针,dessicating胚胎,并执行显微注射技术演示。
Abstract
在这个视频,Nijole Jasinskiene演示方法生成的转基因埃及伊蚊蚊子,登革热的病媒。正确准备显微注射针,dessicating胚胎,并执行显微注射技术演示。
Protocol
在显微注射前的制备
- 血喂蚊子:从周一至在上周四周五饲料女性注射。
- 准备使用方案3或2(见材料)的玻璃针。
- 铺设管的胚胎,是果蝇文化小瓶。湿脱脂棉在底部,一个覆盖它的过滤纸的湿磁盘。
- 准备贴双面胶的一端塑料盖滑。修剪磁带覆盖滑,因此,它在盖玻片边缘结束。
- 准备干燥油(见材料)
- 150毫升塑料烧杯中,用湿药棉覆盖的湿滤纸(80毫米滤纸)上保持注射后的胚胎,在底部。
设立被迫铺设
- 收集与使用抽吸6-10血液美联储女性,他们转移到果蝇用湿棉花和滤纸文化小瓶。
- 把蚊子在黑暗的insectory条件,并允许打好鸡蛋为1小时和15分钟。
- 让成年人飞入笼,并与胚胎取出滤纸盘。
- 排队蛋,这样做的根据解剖的范围。使用细钳5号或罚款的画笔,拿起灰色到灰色黑乎乎的胚胎,并安排3MM的Whatman纸用清水浸泡平方米。所有胚胎必须在相同的方向,注射后极。前年底的胚胎比后部略宽。按滤纸吸干(湿的东西不会粘到磁带)与胚胎干滤纸。要传输的鸡蛋,含双面胶带反转幻灯片和对鸡蛋轻轻按下。后结束的鸡蛋都必须非常接近边缘的双面胶带。
- 约1分钟变干的胚胎。在室温下。他们干的,他们开始略有酒窝。
- 封面,干涸的卤烃油胚胎,以防止进一步的干燥。
微量注射胚胎
- 最重要的是良好的注射针的质量(见材料)。
- 要通过使用一个microloader注入的DNA溶液填充一针。需要很少的注射液是:1至2μL。
- 连接针Transjector,控制注射时间(MANU)和压力(600),和背压(250)。使用移动阶段(徕卡)× 10的放大倍率和显微显微镜进行显微注射。如果有必要,提出显微镜阶段可能准备堆放4-5显微镜幻灯片。将盖玻片上提出阶段进行胚胎。水平注入胚胎,以防止endochorion撕裂;渗透,应在后极。注射,我把针固定和移动显微镜的阶段。
- 注入0.2-0.5 NL的解决方案,相应的胚胎体积约1-5%。通过调整注射压力和时间的控制注射量。微微鞠躬,干涸的胚胎,应该恢复他们的肿胀外观注射后。
- 接盖,用细镊子或罚款刷滑的胚胎,并将其放置在一个用湿棉和湿滤纸的塑料烧杯。用纸巾覆盖烧杯。保持与周围边缘的松紧带,并返回到4天的insectary条件。
注射后
- 四天后,小心地将胚胎纸,胚胎的一面朝下,在水的大塑料盒,用少量的食物。胚胎在很长时间内孵化:不扔出去,直到注射后至少4-5周的文化。
注释
DNA注射
质粒DNA溶液注射使用EndoFree质粒试剂盒分离。建设和辅助质粒正确的浓度混合,沉淀与izopropanol。在注射缓冲区resuspending前用70%乙醇洗涤沉淀。注射前,干净的DNA使用Millex - GV列。
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
1x Injection solution | Buffer | 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8 | ||
Construct plasmid | DNA | 0.5 mg/ml. | ||
Helper plasmid | DNA | 0.3 mg/ml | ||
EndoFree Plasmid kit | Kit | Qiagen | ||
Millex-GV column | SLGV RO4 NL | To clean DNA. | ||
Glass puller | Instrument | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50 |
Quartz puller | Instrument | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
Injection glass needles | Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument). | |||
Aedes aegypti | Animal | Male and female mosquitos, to obtain embryos. | ||
Drosophila culture vial | For mosquito egg-laying. | |||
Halocarbon oil | Reagent | Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1) | ||
Forceps No5 | Tool | |||
Fine paintbrush | Kolinsky Sable | No. 0000 | ||
Whatman paper | Tool | |||
Microloader | Tool | Eppendorf | 5242 956.003 | |
Transjector | Tool | Eppendorf | ||
Microscope | Leica Microsystems | With moving stage and micromanipulator. | ||
3MM Whatman paper | ||||
double sided tape |