Summary
このビデオでは、Nijole Jasinskieneは、デング熱のためのベクトルであるトランスジェニックネッタイシマカ蚊を生成するために採用の方法論を、示しています。正しく、マイクロインジェクションの針を準備する胚をdessicating、およびマイクロインジェクションを行うための手法が実証されています。
Abstract
このビデオでは、Nijole Jasinskieneは、デング熱のためのベクトルであるトランスジェニックネッタイシマカ蚊を生成するために採用の方法論を、示しています。正しく、マイクロインジェクションの針を準備する胚をdessicating、およびマイクロインジェクションを行うための手法が実証されています。
Protocol
マイクロインジェクションの事前準備
- 血液の供給蚊：月曜日から前の木曜日に、金曜日のフィード女性の注射用。
- プログラム3または2を使用して、ガラス針を準備する（資料を参照）。
- 胚のために管を敷設するショウジョウバエの培養バイアルです。それを覆うフィルター紙のウェットディスクと底に湿った脱脂綿、。
- 一方の端に両面テープを貼り付けることによってプラスチックのカバースリップを準備します。それはカバースリップの端で終わるようにスリップをカバーするためにテープをトリミング。
- （資料を参照してください）乾燥のためのオイルを準備
- 注入後の胚を保つためにろ紙のウェットディスク（80ミリメートルワットマン）で覆われた底に湿った綿のウール、と150ミリリットルのプラスチックビーカー。
強制産卵のセットアップ。
- アスピレーターの使用で60から10の血液供給の女性を収集し、湿った綿やろ紙でショウジョウバエ培養バイアルに移す。
- 暗闇の中でinsectory条件に蚊を戻し、および1hと15分間卵をすることができます。
- 大人はケージに飛ぶと胚とろ紙ディスクを削除できます。
- 卵を整列するために、解剖範囲で行ってください。微細な鉗子第5または罰金絵筆を使って、薄暗い灰色の胚に灰色ピックアップし、水に浸した3MMワットマン濾紙の正方形の上の行に配置します。注射は、後極にあるとする必要があるため、すべての胚は、同じ向きになっている必要があります。胚の前端は、後部より少し幅が広いです。 （ぬれたものがテープに付着しない）それに乾燥ろ紙を押すことによって胚と濾紙を乾燥させる。卵を転送するには、両面テープを含むスライドを反転し、静かに卵に対して押してください。卵の後端は、両面テープの端に非常に近いことがあります。
- 1分約胚を乾す。室温で。彼らは、乾くとわずかにディンプルを開始します。
- さらに乾燥を防ぐために、ハロカーボンのオイルで乾燥胚をカバーしています。
胚のマイクロインジェクション
- 良い注射の最も重要な側面は、（資料を参照してください）針の品質です。
- microloaderを使用して注入されるようにDNA溶液を使用してニードルを埋めます。非常に少ない注射液が必要です：1〜2μlを。
- 注入時間（マヌー）と圧力（600）を制御Transjector、、と背圧（250）に針を接続してください。マイクロインジェクションは、× 10の倍率とマイクロマニピュレータで移動ステージ（ライカ）と顕微鏡を使用して実行されます。必要に応じて、調達顕微鏡ステージは4-5の顕微鏡スライドを積層することにより準備されることがあります。発生段階に胚を運ぶカバースリップを置きます。 endochorionの引き裂き防止するために水平に胚を注入し、浸透が後極になっているはず。注射のために、私は針が静止して保持し、顕微鏡のステージに移動。
- 胚の体積の約1から5パーセントに相当する解決策、の0.2から0.5 NLを注入する。射出圧力と時間を調整することで注入量を制御します。わずかに湾曲した、乾燥胚はその仰々しい外観は、次の注射を取り戻す必要があります。
- 微細な鉗子や細かいブラシを使ってカバースリップから胚を選択し、ウェットコットンやウェットフィルター紙とプラスチック製のビーカーの中に置いてください。ティッシュペーパーでビーカーをカバー。リム周りゴムバンドとした場所に保管し、4日間昆虫館条件に戻ります。
ポスト噴射
- 四日後には、慎重に食品の少量の大きなプラスチックボックスに水で、ダウン胚側、胚の用紙を置き。胚は非常に長い期間にわたってハッチ：少なくとも4-5週間後に注入するまでの文化を捨てていない。
ノート
注入用DNA
注射のためのプラスミドDNA溶液をEndoFreeプラスミドキットを用いて単離した。 izopropanolで沈殿、右側の濃度で一緒に構築し、ヘルパープラスミドミックス。ペレットは射出バッファーで再懸濁する前に70％エタノールで洗浄した。マイレクス- GVのカラムを使用して注入する前に、きれいなDNA。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Injection solution | Buffer | 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8 | ||
| Construct plasmid | DNA | 0.5 mg/ml. | ||
| Helper plasmid | DNA | 0.3 mg/ml | ||
| EndoFree Plasmid kit | Kit | Qiagen | ||
| Millex-GV column | SLGV RO4 NL | To clean DNA. | ||
| Glass puller | Instrument | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50 |
| Quartz puller | Instrument | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| Injection glass needles | Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument). | |||
| Aedes aegypti | Animal | Male and female mosquitos, to obtain embryos. | ||
| Drosophila culture vial | For mosquito egg-laying. | |||
| Halocarbon oil | Reagent | Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1) | ||
| Forceps No5 | Tool | |||
| Fine paintbrush | Kolinsky Sable | No. 0000 | ||
| Whatman paper | Tool | |||
| Microloader | Tool | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Transjector | Tool | Eppendorf | ||
| Microscope | Leica Microsystems | With moving stage and micromanipulator. | ||
| 3MM Whatman paper | ||||
| double sided tape |
