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Neuroscience

Strategie per lo Studio delle Neuroprotezione dal freddo precondizionamento

Published: September 2, 2010 doi: 10.3791/2192
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurology, The University of Chicago Medical Center

Summary

Cerchiamo di definire la segnalazione neurali immunitario responsabile freddo precondizionamento come mezzi per identificare nuovi obiettivi per lo sviluppo di terapie per proteggere il cervello prima di insorgenza lesioni. Vi presentiamo le strategie per questi lavori che richiedono sistemi biologici, manipolazioni sperimentali oltre a capacità tecniche che sono altamente riproducibili e sensibili.

Abstract

Danno neurologico è una causa frequente di morbilità e mortalità da anestesia generale e delle relative procedure chirurgiche che possono essere alleviati dallo sviluppo di un efficace, facile da amministrare e sicura trattamenti precondizionamento. Cerchiamo di definire la segnalazione neurali immunitario responsabile freddo precondizionamento come mezzi per identificare nuovi obiettivi per lo sviluppo di terapie per proteggere il cervello prima di insorgenza lesioni. Basso livello pro-infiammatorie mediatore segnalazione variazioni nel tempo sono essenziali per freddo precondizionamento neuroprotezione. Questa segnalazione è coerente con i principi fondamentali di ormesi condizionata fisiologica, che richiedono che gli stimoli irritativi raggiungere una soglia di grandezza con il tempo sufficiente per l'adattamento agli stimoli per la protezione a diventare evidente.

Di conseguenza, la definizione del sistema immunitario coinvolte nella segnalazione freddo precondizionamento neuroprotezione richiede che i sistemi biologici e le manipolazioni sperimentali, più capacità tecniche sono altamente riproducibili e sensibili. Il nostro approccio è quello di utilizzare le culture fetta dell'ippocampo come un modello in vitro che riflette da vicino le loro controparti in vivo con le reti neurali multi-sinaptica influenzato da maturo e quiescenti macroglia / microglia. Questo stato gliale è particolarmente importante per la microglia, poiché sono la principale fonte di citochine, che sono operative nel campo femtomolar. Inoltre, le culture fetta possono essere mantenuti in vitro per diverse settimane, che è il tempo sufficiente ad evocare l'attivazione di stimoli e di valutare le risposte adattative. Infine, le condizioni ambientali possono essere accuratamente controllati utilizzando culture fetta in modo che citochine segnalazione di freddo precondizionamento può essere misurata, imitato, e modulata a sezionare gli aspetti nodo critico. Analisi del sistema di segnalazione delle citochine richiedono l'uso di tecniche di multiplex sensibili e riproducibili. Noi usiamo PCR quantitativa per il TNF-α per lo screening per l'attivazione della microglia seguito da quantitativa in tempo reale lo screening qPCR array per valutare tessuto modifiche a livello di citochine. Quest'ultimo è un mezzo più sensibile e riproducibile per misurare sistema multiplo di citochine segnalazione cambiamenti contemporaneamente. I cambiamenti significativi sono confermati con qPCR mirati e poi il rilevamento delle proteine. Noi sonda per i cambiamenti citochine tessuto a base di proteine ​​mediante citometria a flusso multiplex saggi microsfere utilizzando la tecnologia Luminex. Cell-specifica produzione di citochine è determinato con il doppio marchio di immunoistochimica. Nel loro insieme, questa preparazione tessuto cerebrale e lo stile di utilizzo, unita alle strategie suggerite investigativo, può essere un approccio ottimale per identificare potenziali bersagli per lo sviluppo di nuove terapie che potrebbero imitare i vantaggi del freddo precondizionamento.

Protocol

Tecniche sterili ed asettiche sono fondamentali per la preparazione, manutenzione e uso di colture fetta per lunghi periodi. Inoltre, il razionale per il nostro uso di colture fetta solo dopo 18 giorni in vitro, si basa su prove che indicano eccitatorie e inibitorie trasmissione sinaptica diventa più maturo, e glia (astrociti e microglia) diventano quiescenti e coerenti con le loro controparti in vivo (Figura 1 ).

1. Preparazione e manutenzione delle Culture Slice ippocampale

  1. Lo stesso giorno di coltura, equilibrare inserti sterile nei media ml 1,1 di crescita costituito da 50 ml di mezzo Aquila basale, 25 mL di Earle soluzione salina bilanciata, 23 ml siero di cavallo, 0,5 mL Glutamax (200 magazzino mM), 0,1 mL gentamicina (10 mg / mL stock), 0,4 ml Fungizone (250 mg / ml), 1,45 ml di D-glucosio (45%, 42 mM totale).
  2. Tenere ben sei vassoi in un incubatore a 36 ° C, l'anidride carbonica del 5% e il 95% di umidità.
  3. Per la massima sterilità, la coltura è idealmente fatto in una camera a pressione positiva filtrata HEPA cultura con l'aria purificata anche attraverso self-contained luce ultravioletta aria di pulizia ventilatori, e mentre indossa un camice pulito laboratorio e guanti sterili tesa su maniche della giacca il laboratorio .
  4. Preparare culture fetta in una cappa BSL-1 laminare fumi che include tutti i materiali necessari (per esempio, chopper tessuto McIlwain, relativi inserti in teflon, lama di rasoio affettare, dissezione a freddo (3-4 ° C) piastra, strumenti chirurgici, e dissezione capsule di Petri) utilizzando un Selvaggio (M8) stereomicroscopio.
  5. Lasciare che la piastra di raffreddamento (eseguito da un bagno d'acqua nelle vicinanze) per raggiungere 3-4 ° C di temperatura per almeno 30 minuti, mentre allo stesso tempo esponendo materials dissezione alla luce ultravioletta per stabilire ulteriori sterilità del area e strumenti di dissezione.
    1. La cappa a flusso laminare è testato periodicamente per assicurare la luce ultravioletta ha una potenza sufficiente a livello di tavolo con un metro di misurazione della luce ultravioletta a onde corte.
  6. Usa ratti (P8-P9 e ~ 23 g / cad. Cucciolate da abbattuti a 10 alla nascita) anestetizzati con l'anidride carbonica al 100% in una scatola di piccolo animale su un banco asettico dietro la cappa dei fumi e puliti per immersione in etanolo 100% entro la cappa, dove si svolgono tutte le fasi successive.
  7. Decapitare cuccioli in una metà di un piatto 100 mm Petri e posto la testa nella seconda metà, con un piatto fresco per ogni cucciolo.
  8. Sezionare il cervello e lo inserirà nella metà inferiore di un piatto 60 millimetri Petri contenenti 10 mL sterile a freddo (3-4 ° C) Sale Gey di soluzione equilibrata integrato con il D-glucosio a 6,5 ​​mg / ml (cioè 7,5 ml di 45 % d-glucosio per 500 ml di Gey è.
  9. Sezionare il ippocampo da ogni emisfero e metterli su un disco in teflon per l'elicottero McIlwain. Mezzi di diffusione di distanza dal tessuto cerebrale utilizzando una spatola iride per evitare sezioni cervello taglio di aderire alla lama di taglio.
  10. Sezione perpendicolare dell'ippocampo alla loro asse longitudinale utilizzando l'elicottero McIlwain, con spessore della sezione fissato a 350-400 micron.
  11. Vivacemente lavare appena tagliato fette fuori degli inserti in teflon e la metà superiore di un piatto 60 millimetri Petri contenenti freddo (3-4 ° C) soluzione salina bilanciata Gey con 6,5 mg / ml di D-glucosio utilizzando una pipetta ml.
  12. Ispezionare fette con lo stereomicroscopio per un giro dentato intatto e strato di cellule piramidali.
  13. Posizionare con delicatezza il più grande fette su un inserto (tre per inserire e 12 fette / piccoli) e mantenere in condizioni normali di incubazione in un incubatore pulite ogni sei mesi e calibrato ogni tre mesi con un analizzatore a raggi infrarossi di anidride carbonica e termometro di precisione con una cifra decimale.
  14. Terreni di coltura in piastre di coltura aggiornamento ogni 3-4 giorni in vitro utilizzando un BSL-2 cappuccio e tecnica sterile.
  15. Dopo 7 giorni in vitro, sostituire i media con 1,1 ml di siero-multimediale gratuito (SFM) composto di 97 mL Neurobasal, B27 2 mL, 0,5 mL Glutamax (200 mm), 0,1 ml di acido ascorbico (0,5 M), e 0,68 ml di D- glucosio (45%, 42 mM totale).

2. Pre-schermo vitalità delle culture per Slice

  1. Aliquota Sytox verde magazzino (10 mL) e conservare a -20 ° C.
  2. Diluire la Sytox a 500 Nm di lavoro nel siero senza mezzi crescita (cioè, 10 L in 100 ml di mezzi di comunicazione). Conservare Sytox mezzi a 4 ° C e l'uso per un massimo di una settimana.
  3. Mettere 1,1 ml di Sytox per bene in 6 piatti ben caldi e cultura a 36 ° C al di anidride carbonica del 5% per un periodo sufficiente (cioè, come evidenziato dalla mancanza di condensa sui piatti della cultura).
  4. Nel frattempo, permettono una lampada a raggi ultravioletti (cioè, una fonte di luce fluorescente con un filtro FITC) alimentato tramite un alimentatore stabilizzato per assicurare l'intensità della luce uniforme a temperatura per almeno 20 min.
  5. Luogo culture fetta (18 giornis in vitro) in Sytox-media per 10 minuti e poi di nuovo al SFM per lo screening della lesione irreversibile CA1 strato piramidale.
  6. Vedi le culture su una superficie asettica di un microscopio invertito, esaminati sotto ingrandimento 5x.
  7. Accettare culture con meno di 30 cellule Sytox positivo nella zona CA1.

3. A freddo di precondizionamento

  1. Mettere 1,1 ml di SFM in 6 pozzetti piatti della cultura. I supporti raffreddamento (per esempio, 30 ° C) per equilibrare in un (anidride carbonica del 5% e 95% di umidità) incubatore per almeno 20 minuti prima dell'uso. Assenza di condensa sui piatti della cultura indica che un tempo adeguato per equilibrio si è verificato.
  2. Trasferimento inserti cultura fetta ai media raffreddato (1,1 mL / pozzetto) vassoio mantenuto a 30 ° C e incubare per 90 minuti utilizzando una tecnica sterile in una cappa BSL-2 dei fumi.
  3. Luogo culture fetta indietro nel SFM normale in condizioni normali di incubazione per 24 ore, sempre con tecnica sterile attraverso un BSL-2 cappa.

4. Lesioni eccitotossico

  1. Iniziare fetta preselezione uso sperimentale cultura esponendo ai media Sytox per 20 min.
    1. Acquisire immagini fetta individuali con fette mantenuta a un orientamento simile a quello usato per la preselezione (immagini di sfondo). Questo viene fatto mettendo un segno di sinistra e due marchi a destra con pennarello a "10" e "due" ore per ogni inserimento. Questa manovra facilita l'utilizzo della stessa area di interesse per ogni forma di cultura set di immagini.
  2. Allo stesso tempo, accendere la lampada sorgente di raggi ultravioletti (con alimentazione regolata), e camera CCD per un minimo di 20 minuti in modo da riscaldare a temperatura.
  3. Poi, calibrare la telecamera CCD con uno standard fluoroscein.
    1. "Clear" del CCD esponendolo alla luce per 50 cicli di meno che una telecamera CCD controllo automatico delle calibrazioni viene utilizzato. Abbiamo stabilito un programma all'interno di MetaMorph per sgombrare le nostre telecamere freddo Snap utilizzati per la quantificazione lesioni.
    2. Introdurre 10 ml di fluoroscein in 90 ml di PBS (tampone fosfato 10 mM, NaCl 150 mM a pH 7,3) e vortice.
    3. Pipettare 10 ml di miscela fluoroscein su un emocitometro 100 micron di profondità.
    4. Regolare la massima intensità dell'immagine 1000/4096.
  4. Raccogliere le immagini di sfondo delle culture fetta di verificare che freddo precondizionamento non ha causato danni (ossia eliminarlo culture con ≥ 250 CA1 zona di intensità interesse).
  5. Preparare i vassoi con i media NMDA.
    1. Preparare 10 soluzione madre mM di NMDA almeno settimanale.
    2. Per lesioni eccitotossico, diluire NMDA a 20 50 micron di SFM e portare a normali condizioni di incubazione per almeno 20 min.
  6. Utilizzando il BSL-2 cappuccio e tecnica sterile, inserisce posto nel NMDA-media per 60 minuti in condizioni normali di incubazione.
  7. Risciacquare NMDA off di inserti immergendo ogni inserire tre volte in tre distinti 60 piatti mm ciascuno contenente 10 mL Neurobasal riscaldato a 36 ° C. Non utilizzare più di tre inserti per ogni set di piatti 60 mm a tre lavaggio.
  8. Ritorna culture normali condizioni di incubazione.
  9. Raccogliere immagini lesioni 24 ore dopo l'esposizione al NMDA.
    1. Calibrare la telecamera con fluoroscein standard come descritto in precedenza.
    2. Culture posto nei media Sytox per 20 min.
  10. Quantificare infortuni:
    1. Utilizzando il software MetaMorph, disegnare un AOI intorno CA1 regione.
    2. Misura l'intensità della regione selezionata per "lesioni".
    3. Copia e incolla AOI da "lesioni" a immagine di "sfondo".
    4. Immettere i valori da "pregiudizio" e "sfondo" in Excel.
    5. Quantificare "numeratore-fondo" per il controllo e freddo precondizionato culture.
    6. Utilizzando un software statistico (ad esempio, SigmaStat), eseguire appropriati test statistici per confrontare lesioni del gruppo sperimentale (s) contro un gruppo di controllo, che dovrebbe sempre essere incluso in ogni corsa sperimentale.
    7. Nota: Se i livelli di lesione a basso contenuto di una giornata post-infortunio immagini, riporto in esperimento di due tre giorni. Protezione in culture possono essere mascherati a causa della mancanza di possibilità di lesioni (Figura 2).
    8. Nota: La questione della "protezione" ci ha spinto a passare a livelli di lesione di misura e non i rapporti per tutti i confronti (Figura 3).

5. Co-trattamenti applicati con freddo precondizionamento

Un vantaggio importante di culture fetta è quella condizione ambientales può essere accuratamente controllato. Ciò significa che citochine segnalazione da freddo precondizionamento può essere misurata, imitato, e modulata a sezionare gli aspetti nodo critico.

  1. Ricombinanti (ad esempio, agonista), proteine ​​e neutralizzanti (per esempio, anticorpi o recettori solubili) le proteine ​​possono essere usate per simulare e modulare, rispettivamente, di segnalazione delle citochine.
  2. In generale, queste proteine ​​sono ricostituiti e conservati come aliquote a -20 ° C per l'impiego entro sei mesi per garantire la bioattività adeguata.
  3. Qui, descriviamo l'uso esemplare di TNF-α abrogazione segnalazione utilizzando recettore solubile del TNF 1 (sTNFR1).
    1. Ricostituire sTNFR1 nel 0,1% di BSA in PBS per uno stock di 50 mg / mL, aliquota nel 20-50 microlitri quantità, e conservare a -20 ° C.
    2. Per l'uso, diluire sTNFR1 a 200 ng / ml nei media la crescita culture fetta riscaldato a 36 ° C e culture posto fetta di sTNFR1-media per 20 minuti prima di freddo precondizionamento.
      1. Nota: Per ridurre la varianza, si consiglia di diluire 200 ng / mL sTNFR1 in un grande volume di crescita dei media (cioè 1:250 diluizione da 50 mg / ml sTNFR1 magazzino in 10 ml di terreni di crescita richiede 40 microlitri sTNFR1) vs aggiungendo sTNFR1 direttamente a ciascun bene in piatto (4,4 microlitri per i media 1,1 ml).
    3. Diluire sTNFR1 a 200 ng / ml nei media e il luogo in 1,1 ml ogni inserto bene. Consente alla carta di equilibrare a 30 ° C per almeno 20 minuti prima dell'esposizione culture fetta a freddo di condizionamento per 90 minuti come descritto sopra.
    4. Luogo culture fetta indietro a 36 ° C con sTNFR1 presente nei media.
    5. 24 ore dopo, esporre le culture di Sytox media per 20 minuti come descritto in precedenza e raccogliere immagini di sfondo per verificare che freddo precondizionamento non danneggiare le culture.
  4. Quantificare i dati come sopra descritto.
  5. Aggiornare i media con componenti ogni 3-4 giorni in vitro.

6. Immediata e ritardata lesioni eccitotossico dopo a freddo precondizionamento

  1. Lesioni immediate con freddo precondizionamento.
    1. Eseguire a freddo precondizionamento come descritto sopra.
      1. Dopo freddo precondizionamento, ritorno culture di incubazione normale per 20 minuti.
      2. Poi, esporre le culture a 20-50 mM lesioni NMDA per un'ora.
      3. Risciacquare culture tre volte come descritto sopra e tornare al normale incubazione.
      4. Dopo 24 ore, acquisizione di foto del pregiudizio di cui sopra.
  2. Ritardato effetti del freddo-precondizionamento.
    1. Eseguire a freddo precondizionamento come descritto sopra.
    2. Esporre a lesioni culture NMDA 24 ore più tardi, come descritto sopra.
    3. Continuare ad acquisire immagini infortunio per un massimo di tre giorni dopo l'iniziale a freddo precondizionamento di monitorare protezione.

7. RNA Isolation

Le seguenti procedure di espressione genica sono in scala per una cultura sola fetta.

  1. Trasferimento culture fetta di terreni di coltura e l'incubazione normale a 3 RNAlater ml in 6 piatti ben cultura per stabilizzare l'RNA. Conservare a 4 ° C per un massimo di tre giorni, fino trattati come descritto di seguito.
  2. Sollevare delicatamente la cultura fetta fuori l'inserto con un pennello sottile vernice punta e posto in 1 ml di freddo (4 ° C) PBS in una ml 1,5 (DNasi, RNasi e DNA libero) provetta.
  3. Centrifugare i campioni per 30 sec e rimuovere PBS surnatante.
  4. Conservare i campioni a -80 ° C.
  5. Per isolare l'RNA da culture fetta (~ 250 ng / cad.), I campioni di disgelo sul ghiaccio.
  6. Isolare RNA utilizzando il kit Qiagen MicroRNeasy attraverso le seguenti procedure che sono descritti in dettaglio e adattato dal Micro RNeasy Handbook (Qiagen).
    1. Complessivamente 350 RLT Buffer microlitri (contenente 10 L β-mercaptoetanolo per mL) in ciascuna provetta contenente una fetta di cultura.
    2. Omogeneizzare campioni vortex per 30 sec. Triturare il tessuto, se necessario (cioè, precipitato di tessuto ancora visibile) con un pestello e getta fino a completa omogeneizzazione nel buffer RLT.
    3. Complessivamente 350 ml di etanolo al 70% nel mix lisato e pipetta per mescolare.
    4. Trasferimento omogenato a una colonna di spin e posto in un tubo di raccolta (sia Spin Column e tubo di raccolta sono forniti da Qiagen).
    5. Centrifugare campione per 15 secondi alla massima velocità. Mantenere la colonna.
    6. Lavare la colonna di rotazione con l'aggiunta di 350 microlitri RW1 Buffer più centrifugare per 15 secondi alla massima velocità. Scartare buffer.
    7. Diluire 10 ml di DNasi I buffer in 70 microlitri RDD cedere 80 microlitri di volume totale. Pipettare delicatamente per mescolare non vortice. Preparare 80 ml di diluito magazzino DNasi per campione. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
    8. Aggiungere 350 microlitri RW1 Buffer a campione Spin Column e centrifugare per 15 secondi. Eliminare Collection Tube.
    9. Utilizzando un nuovo tubo di raccolta, aggiungere 500 microlitri Buffer RPE per il campionamento e centrifuga per 15 sec e scartare buffer.
    10. Mettere 500 ml di etanolo all'80% del campione e centrifugare per 2 min. Eliminare il tubo di raccolta.
    11. Asciugare le colonne giro per centrifugazione per 5 minuti a velocità massima con tappi tubo aperto, scartare i tubi di raccolta, e spin colonna trasferire in una provetta da 1,5 ml di raccolta fornito dal kit.
    12. Per raccogliere RNA isolato, posto 14 microlitri RNasi-free acqua sul centro della membrana colonna. Centrifugare per un minuto e raccogliere il liquido.
    13. Aggiungere 2 ml di RNasin (diluito a 1 U / mL in tampone TE) e conservare a -80 ° C. TE buffer consiste di 10 mM Tris (Tris [idrossimetil] amminometano), 1 mm di EDTA (etilendiamminotetraacetico acido idrato di sale disodico) a 8,0 pH.

8. Quantificazione dell'RNA

  1. Nota: RNasin non interferisce con il test RiboGreen.
  2. Diluire RiboGreen 1:200 in RNasi-free tampone TE come segue.
    1. TE (ml): 1; Ribogreen (mL): 5;
    2. TE (ml): 4; Ribogreen (mL): 20;
    3. TE (ml): 6; Ribogreen (mL): 30.
  3. Standard di RNA sono preparato come segue.
    1. Lievito tRNA viene utilizzato come standard di RNA. tRNA viene memorizzato (-20 ° C) come 1 mg / ml in tampone TE.
    2. Diluire il 1 mg / ml magazzino 1:100 in tampone, utilizzando (DNasi, RNasi e DNA libero) 1,5 microprovette ml per produrre un 1 mg / mL di lavoro standard.
    3. Preparare la curva standard direttamente in una piastra a 96 pozzetti test di fluorescenza con l'aggiunta del tampone TE diluente, poi aggiungendo la quantità appropriata della mg / ml 1 standard nel buffer TE già nei pozzetti piastra come mostrato nella tabella accanto. Fai pozzetti per ogni standard come segue.
      1. Vol. di std. (ML): 100; vol. di TE (mL): 0; RNA nel bene (ng): 100;
      2. Vol. di std. (ML): 80; vol. di TE (mL): 20; RNA nel bene (ng): 80;
      3. Vol. di std. (ML): 60; vol. di TE (mL): 40; RNA nel bene (ng): 60;
      4. Vol. di std. (ML): 40; vol. di TE (mL): 60; RNA nel bene (ng): 40;
      5. Vol. di std. (ML): 20; vol. di TE (mL): 80; RNA nel bene (ng): 20;
      6. Vol. di std. (ML): 0; vol. di TE (mL): 0; RNA nel bene (ng): 0.
  4. Il test si prepara come segue.
    1. Aggiungere 99 ml di TE buffer per ciascun pozzetto della piastra campione 96 pozzetti. Il modo più efficace per farlo è di utilizzare una pipetta multicanale.
    2. Aggiungere 1 ml di RNA nei pozzetti del campione sperimentale.
    3. Aggiungere 100 microlitri della RiboGreen diluito ad ogni pozzetto usando il pipettatore multicanale e triturare con uno o due colpi di pipettatore.
    4. Leggere la piastra su un lettore di piastre a fluorescenza a 480 nm di eccitazione e 520 nm di emissione.
    5. Costruire una curva standard utilizzando Microsoft Excel con misurata intensità di fluorescenza di standard RNA.
    6. Calcolare le concentrazioni di RNA in campioni utilizzando l'equazione lineare risultante dalla curva standard.

9. SYBR Green PCR quantitativa

  1. Procedure di PCR sono meglio farlo in un ambiente pulito riservato appositamente per lavorare con l'RNA (Figura 4).
    1. Decontaminare l'area e le attrezzature di laboratorio correlate da potenziale contaminazione del DNA e l'attività RNasi prima di utilizzarlo con luce ultravioletta, 10% di candeggina o RNasi Away.
    2. Indossare guanti durante tutte le procedure.
    3. Usare l'acqua libera RNAsi per tutte le procedure previste con il kit. Non utilizzare DEPC-(diethylpyrocarbonate) acqua trattata.
    4. Chiudere tutte le PCR relativi tubi subito dopo l'uso di aerosol ritardare la contaminazione di DNA estraneo.
  2. Sviluppare e caratterizzare inneschi per l'mRNA bersaglio (s) di interesse. Questi metodi sono precisati nei metodi complementare Hulse et al. Journal of Neuroscience, 2008 13.
  3. cDNA è prodotto 3-20 ng di RNA totale tramite la trascrizione inversa utilizzando iScript.
    1. La scelta della quantità di RNA di partenza è determinato dalla quantità totale di RNA a disposizione con l'obiettivo di effettuare analisi RT-PCR su una parte del campione (cioè, il 10% -20% del totale).
    2. La restante quota maggiore di RNA vengono memorizzati per analisi future.
    3. Il kit iScript utilizza una miscela di esameri casuali e oligo-dT primer, e una versione modificata della trascrittasi inversa MMLV in un volume totale di 20 l.
    4. Reverse procede trascrizione per 25 ° C per 30 minuti seguita da 42 ° C per 50 minuti, e la trascrittasi inversa viene successivamente denaturato a 85 ° C per 5 min.
    5. Diluire cDNA in tampone TE alla concentrazione finale di 0,4 ng parente / mL di RNA di partenza quantità.
  4. SYBR Green strategia di PCR, viene utilizzato per amplificare il cDNA.
    1. Le reazioni PCR sono monitorati in tempo reale mediante il monitoraggio SYBR incorporazione verde.
    2. Le 50 reazioni microlitri contiene 3 mM MgCl2, 200 mM dNTPs, 15 pmol di ciascun primer forward e reverse, 1 mM fluoresceina, 1x colorante SYBR Green, 10 L (4 ng) cultura fetta cDNA, e 1.25 U di Taq polimerasi Platinum in reazione tampone costituito da mM KCl 50 e 10 mM Tris, pH 8,3.
    3. PCR viene eseguita utilizzando il termociclatore iCycler che può raccogliere i dati in tempo reale.
    4. Ciclismo parametri costituiti da 15 sec di denaturazione (95 ° C), seguita da 30 sec ricottura / estensione (60 ° C) ripetuto 45 volte.
    5. Misure ottiche vengono prese durante la fase di ricottura / estensione e dei valori Ct sono stati determinati utilizzando il software di sistema iCycler.
    6. cDNA per gli obiettivi delle citochine di interesse e β-actina sono usati per costruire curve standard.
      1. Numero di copie è determinato dal peso molecolare e la massa del cDNA plasmide.
      2. Curve standard del numero di copie / massa sono costruiti e inclusi in ogni test.
      3. I valori Ct per ogni diluizione cDNA vengono utilizzati per determinare il numero di copie v. Ct curva.
    7. Citochine e β-actina livelli del numero di copie sono determinati per i campioni utilizzando le curve standard.

10. PCR quantitativa per Microarrays

Quantitativi in ​​tempo reale lo screening serie qPCR è un mezzo altamente sensibile e riproducibile per la sonda a basso livello di alterazioni infiammatorie espressione mediatore.

  1. Il RT2 Profiler serie PCR di SABiosciences viene utilizzato per alterazioni infiammatorie mediatore di espressione genica, con i seguenti passaggi descritti in dettaglio dal produttore.
  2. Il test utilizza 0,1-1,0 mg di RNA. Noi usiamo le aree fetta locale (ad esempio, che fornisce CA1 ~ 250 ng di RNA totale da due campioni in pool) o interi fette singolo che contengono una quantità simile di RNA totale.
  3. RNA del campione e controllo sono trascrizione inversa a cDNA utilizzando un kit di pronto intervento (ad esempio, C #-03).
    1. Il cDNA risultante è mescolato con SYBR Green a base di mix di PCR (# PA-011) e 25 microlitri aliquotted in ciascuno dei 96 pozzetti della piastra di serie PCR (misura 84 geni unici sperimentale e 16 geni housekeeping).
    2. Una piastra array è preparato per il campione sperimentale e un secondo piatto viene preparato per il controllo.
    3. Nota: Il master SYBR Green mix fornito dal produttore è termociclatore-specifici.
  4. Cicli termici viene effettuata utilizzando un iCycler con un protocollo 40 ciclo costituito da una fase di denaturazione di 15 sec a 95 ° C seguita da una fase di estensione di un min a 60 ° C. Dati ottici vengono raccolti durante la fase di estensione. Cicli termici è seguita da un'analisi della curva sciogliere la scansione del 55-95 ° C di temperatura gamma in incrementi di 0,5 ° C.
  5. L'espressione relativa dei geni in lastre trattate e di controllo è stata determinata utilizzando il 2 - metodo ΔΔCt utilizzando il software fornito di Excel base ed espresso in un aumento o una diminuzione volte rispetto ai controlli.
  6. Geni con duplice aumenta o diminuisce di espressione sono considerati per un'ulteriore valutazione.
  7. Geni identificati dallo screening serie PCR (ad esempio, usando # Parn-011A per il freddo precondizionamento) sono ulteriormente confirmed utilizzando qPCR.
    1. Array PCR identificare quali geni sono regolati in risposta agli stimoli.
    2. Nell'esempio di freddo precondizionamento, abbiamo identificato il gene IL-11 come positivamente regolata in risposta a freddo precondizionamento.
    3. Il passo successivo è l'analisi per confermare che il gene appena identificato è regolata nelle culture fetta utilizzando il test qPCR cui sopra.

11. Multiplex del flusso di analisi proteomica microsfere Citometria

  1. Esporre le culture fetta di freddo precondizionamento come descritto sopra.
  2. Fetta culture raccolto per dosaggio di proteine ​​totali.
    1. Sollevare delicatamente le fette fuori l'inserto con una messa a punta di pennello e il luogo in 1 ml di freddo (4 ° C) PBS.
    2. Centrifugare e rimuovere i tubi PBS fuori culture fetta. Mettere in ghiaccio secco fino a quando la raccolta è terminata.
    3. Conservare le provette a -80 ° C.
  3. Omogeneizzare campioni cultura fetta per l'esecuzione di un dosaggio proteine ​​totali.
    1. Preparare buffer di lisi cellulare per omogeneizzazione.
      1. Seguendo le istruzioni del produttore (Bio-Rad), aggiungere gli inibitori della proteasi a 5 ml di tampone di lisi e mettere da parte su ghiaccio.
    2. Posto 100 l di tampone di lisi sulle culture fetta e fette agitare pipettando su e giù per cinque volte con una punta di 100 microlitri pipetta sezionato per 1 mm.
    3. Agitare i campioni con agitazione a 4 ° C per 20 min.
    4. Centrifugare i campioni a 13.000 rpm per 15 min a 4 ° C.
    5. Trasferire il surnatante in una provetta pulita e mettere da parte su ghiaccio.
  4. Eseguire test proteine ​​totali.
    1. Preparare BSA (albumina di siero bovino) standard di proteine.
      1. Ricostituire magazzino BSA con acqua ultrapura secondo le istruzioni del produttore.
      2. Preparare gli standard di proteine ​​che vanno 0.000-1.000 mg / ml, diluito in tampone di lisi.
    2. Calcolare il volume di reagente di lavoro necessario in base alle istruzioni del kit.
      1. Per esempio, (otto standard + 18 campioni sconosciuti) x (due repliche) x (200 microlitri di reagente di lavoro necessario per campione) = 10,4 mL di volume totale di reagente di lavoro necessario a caricare su una micropiastra da 96 pozzetti (ad esempio, test di citometria a flusso microsfere , vedi sotto).
      2. Quando la miscelazione dei reagenti A con Reagente B, alcuni torbidità si possono verificare, ma dovrebbe scomparire a breve.
    3. Carico 10 ml di standard e dei campioni sulla micropiastra.
    4. Carico di 0,2 ml di reattivo di lavoro nei pozzi.
    5. Coprire micropiastra con nastro adesivo ed agitare con agitazione per 30 sec.
    6. Micropiastra incubare a 37 ° C per 30 min.
    7. Micropiastra raffreddare a temperatura ambiente (circa 10 min) prima di leggere su un lettore di piastre a 595 nm.
    8. Costruire una curva standard utilizzando Microsoft Excel con assorbanze misurate degli standard di BSA.
    9. Calcolare le concentrazioni di proteine ​​nei campioni utilizzando l'equazione lineare risultante dalla curva standard.
      1. Diluire tutti i campioni per la più bassa concentrazione misurata con tampone di lisi e conservare a -80 ° C.
  5. Eseguire singolo complesso e citochine tessuto multiplex (o liquido) test come descritto in dettaglio completo di riferimenti # 12 e 16.

12. Immunoistochimica

  1. Fix culture per 24 ore con fissativo PLP costituito da 10 ml paraformaldeide 16%, 1,096 g di lisina, fosfato di sodio 0,42 g, periodato e 0,17 g di sodio, riempito per un volume totale di 80 mL con acqua ultrapura (fissante è di 6,2 pH).
    1. Troviamo che PLP fissativo è un fissativo delicata che permette la rilevazione di basso livello immunocolorazione che altrimenti non sarebbe evidente con altri fissativi.
    2. Le culture sono fissi per 24 ore e poi trasferito con un pennello fine di PBS contenente sodio azide (100 mg / L).
  2. Immunocolorazione campo chiaro di galleggiare culture fetta intera si realizza come segue con tutte le misure accoppiate a scuotere a ~ 50 giri.
    1. Lavare le culture fetta in 3 ml di PBS per tre volte per 10 minuti.
    2. Quench culture fetta nello 0,3% H 2 O 2.
      1. Diluire 30% H 2 O 2 soluzione stock in PBS.
    3. Lavare le culture fetta in PBS per tre volte, ogni 10 min.
    4. Blocco culture fetta per un'ora a temperatura ambiente in 3 ml di soluzione di blocco in un bambino di sei pozzetti costituito da 10 ml di siero di capra, 0,75 ml di Triton X-100, e 89,25 ml di PBS.
      1. Siero per la soluzione di saturazione deve provenire da una stessa specie in cui è stata sollevata l'anticorpo secondario.
    5. Incubare culture fetta pernottamento in anticorpo primario diluito in soluzione di blocco a 4 ° C.
      1. Il volume massimo di soluzione di anticorpo primario per piccole vetro Pyrex piatto pozzetti devono essere 0,3 ml di volume più elevato tendono a correre oltre il bordo del piatto.
      2. Porre la capsula in un contenitore umidificato chiuso. Non coprire il piatto con una pellicola aderente dal sezioni possono essere filata sulla pellicola sovrastante e perso per workup ulteriormente.
      3. Regolare la velocità di agitazione con agitazione ad appena sufficiente per far circolare le fette nella soluzione di anticorpi.
    6. Togliere le fette dalla piastra di vetro e lavare in PBS per tre volte per 10 minuti a lavaggio.
    7. Incubare a fette anticorpo secondario a temperatura ambiente per un'ora agitando.
      1. Utilizzare piccoli piatti in vetro pyrex per caricare 0,3 mL di soluzione di anticorpo secondario.
    8. Lavare tre volte in PBS, 10 minuti a lavaggio.
    9. Visualizza colorazione con 3'-diaminobenzidina (DAB).
      1. Sciogliere 30 mg DAB in 3 ml di dimetil solfossido.
      2. Filtro DAB utilizzando due # 1 carta da filtro e lavare con 54 ml di PBS.
      3. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere 20 ml di 30% di H 2 O 2.
      4. Incubare culture in soluzione DAB per 5-7 minuti a temperatura ambiente.
      5. Nota: DAB è una sostanza cancerogena e deve essere smaltito correttamente. Disporre di tutte le soluzioni DAB in un contenitore marcato memorizzati in una cappa aspirante, tutti i piatti e il luogo in soluzione di candeggina per disattivare DAB. Tutte le soluzioni DAB in definitiva dovrebbe essere eliminata tramite l'Ufficio di sicurezza istituzionali.
    10. Lavare le culture fetta in PBS per tre volte per 10 minuti ciascuno.
    11. Wet culture fetta montare alla gelatina (o silano) vetrini rivestiti con 100 microlitri sapone disciolto in acqua distillata. Asciugare durante la notte a temperatura ambiente.
      1. Evitare l'uso di scalda-scivolo calore eccessivo possono provocare crepe nelle culture montato diapositive.
    12. Disidratare diapositive attraverso una serie graduata di etanolo (50, 75, 95, 95, 100, 100%) per 30 secondi ciascuna.
    13. Diapositive chiaro con xilene quattro volte per dieci minuti ciascuno.
    14. Usando una pipetta Pasteur di vetro, posto 0,1 mL di mezzi di montaggio sulla parte superiore del vetrino e coprioggetto delicatamente per evitare la formazione di bolle d'aria. Asciugare durante la notte a temperatura ambiente.
  3. Immunocolorazione fluorescenti.
    1. Sezione culture fetta a 20 micron di spessore utilizzando un criostato.
      1. Regolare le impostazioni criostato a -16 ° C per la temperatura interna, e -12 ° C per la temperatura degli oggetti.
      2. Mettete una piccola quantità di acqua sul mandrino metallico con una pipetta Pasteur e congelamento in ghiaccio secco.
      3. Applicare uno strato sottile disco di Tissue-Tek supporti sulla parte superiore del mandrino congelati.
      4. Lasciare mandrino di congelare e portare a temperatura della camera di criostato.
      5. Sezione di tessuto-Tek media per creare una superficie piatta adatto per la posa di culture fetta piatta.
      6. Notare l'orientamento del mandrino, mentre sezionamento questo fornisce un angolo coerente per sezionamento che impedirà mezzi di montaggio cadere dal mandrino.
      7. Quando congelato, prendere mandrino fuori luogo e in un supporto. Con una spatola metallica e una messa a punta di pennello, far scorrere una cultura fetta sulla spatola e trasferimento verso ilmetà dello strato di tessuto appiattito-Tek media sul mandrino.
      8. Mettere un sottile strato di tessuto-Tek multimediali sulla cultura fetta montata e conservare a temperatura della camera per almeno 10 min.
      9. Con il pulsante "Trim" attivata, la sezione degli strati superiori della Tissue-Tek supporto fino a quando la cultura fetta è visibile.
      10. Passare da "tagliare" per preset "sezione" a 20 micron.
      11. Pick-up 20 sezioni micron con gelatina rivestite diapositive temperatura ambiente e diapositive asciugare durante la notte.
      12. Tissue-Tek multimediali saranno visibili su vetrini, ma si scioglie in lavaggi PBS.
    2. Immunocolorazione.
      1. Lavare i vetrini in PBS per tre volte per 10 minuti ciascuno.
      2. Quench nello 0,3% H 2 O 2 per 15 minuti a temperatura ambiente agitando.
      3. Lavare i vetrini in PBS per tre volte per 10 minuti ciascuno.
      4. Utilizzando SFX potenziatore di segnale, applicare alcune gocce di Componente A direttamente sulla parte superiore delle sezioni su vetrino e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata.
        • Incubazione con Componente A sostituisce il blocco passo con la soluzione di capra 10% di siero immunoistochimica eseguita in campo chiaro.
      5. Diapositive incubare in anticorpo primario diluito in 0,75% Triton X-100 in PBS per due ore a 37 ° C.
        • Applicare la soluzione primaria di anticorpi direttamente alla parte superiore di diapositive e incubare in camera umidificata per evitare l'evaporazione.
        • Non includere nel siero in nessuna delle soluzioni di anticorpi utilizzare solo PBS e Triton X-100.
      6. Lavare i vetrini in PBS per tre volte per 10 minuti ciascuno.
      7. Incubare anticorpo secondario per un'ora a temperatura ambiente e proteggere diapositive dalla luce.
        • Centrifuga tutti gli anticorpi secondari fluorescenti per 20 minuti per evitare di ottenere aggregati nella soluzione di anticorpi.
        • Preparare le diluizioni di anticorpi con 0,75% Triton X-100 in PBS.
      8. Lavare i vetrini in PBS per tre volte per 10 minuti ciascuno.
      9. Immergere i vetrini una volta in acqua distillata per lavare i sali da PBS.
      10. Diapositive asciugare durante la notte a temperatura ambiente, coperto al riparo dalla luce.
      11. Coprioggetto diapositive con Antifade prolungare il programma MEDIA.
        • Componente disgelo A in microonde per 5-10 secondi e aggiungere circa 1 ml di una fiala di componente B. Mescolare con una pipetta Pastuer, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella soluzione.
        • Centrifugare per 5 minuti alla massima velocità per rimuovere le bolle.
        • Applicare uno strato sottile di prolungare il programma MEDIA all'inizio della presentazione utilizzando una pipetta Pastuer, attento a evitare di creare eventuali bolle d'aria.
        • Posizionare delicatamente scivolare coperchio sulla parte superiore del vetrino e asciugare durante la notte, coperto al riparo dalla luce.
      12. Doppia etichetta immunocolorazione fluorescente (Figura 5).
        1. Eseguire fluorescenti immunocolorazione come descritto sopra, ad eccezione di diluire gli anticorpi primari sia nella soluzione di incubazione stesso.
        2. Diluire tutti gli anticorpi secondari nella stessa soluzione e incubare come descritto sopra.
        3. Periodi di incubazione di serie che utilizza due anticorpi portato a immunocolorazione diminuita.

13. Rappresentante Risultati

Figura 1
Figura 1. Aspetto di culture fetta dell'ippocampo e microglia. L'immagine a sinistra mostra una tipica maturo (cioè, 21 giorni in vitro) cultura fetta dell'ippocampo macchia con NeuN (verde) per illustrare il citoarchitettura dei neuroni principali. Neuroni piramidali sono mostrati in aree CA1 e CA3 e ammaccaturamangiò giro (DG) i neuroni a sinistra. Barra di scala è di 250 micron. L'immagine di destra è derivato dalla zona CA1 e mostrato a più alto potere di illustrare la qualità ramificata della microglia quiescenti all'interno delle culture fetta maturo. Le cellule sono state contrassegnate con il marcatore di superficie microglia, CD11b. Barra di scala è di 50 micron.

Figura 2
Figura 2. Freddo precondizionamento neuroprotezione nelle culture fetta ippocampale. Culture vengono incubati con Sytox verde, un marcatore fluorescente segnato cellule morte. La riga superiore mostra colture di controllo farsa e la riga inferiore mostra fette esposti a 28 ° C per 90 min. Mano sinistra, pre-schermo le immagini non mostrano lesioni CA1. Relativo colore scala delle lesioni calibrazione è mostrato nell'immagine in alto a sinistra. Immagini fila centrale mostrano relativa lesione cultura fetta 24 ore dopo l'esposizione a 20 micron NMDA. Si noti che il pregiudizio controllo sham è superiore a quello di culture esposti al freddo precondizionamento (CP). Tradizionalmente, le culture vengono poi esposti a 20 micron NMDA CA1 durante la notte per massimizzare i livelli di danno neuronale e lesioni relativo di CP v. finzione, noto come rapporto di lesioni / ferite massima. Tuttavia, l'esposizione a stimoli lesioni massima non può essere sufficiente per superare la neuroprotezione dal precondizionamento. Di conseguenza, uso dei rapporti di lesioni / ferite massimi possono non riflettere accuratamente neuroprotezione dal precondizionamento. Questo è evidente nelle immagini di destra che mostrano CP livelli massimi sono inferiori a quelle dei controlli farsa.

Figura 3
Figura 3. Schematico che illustra l'utilità di usare iniziale, le misurazioni primo giorno di quantificare i livelli di lesione a freddo precondizionamento esperimenti. Come notato in precedenza, abbiamo trovato che l'uso di rapporti (lesioni / ferite massimo) potrebbe oscurare neuroprotezione da freddo pre-condizionamento. Questo si può vedere dallo schema a sinistra dove viene mostrato lesioni farsa in rosso e che, dopo freddo precondizionamento in blu. Un giorno dopo l'esposizione a freddo NMDA precondizionamento mostra un relativo livello "3" di lesioni v. farsa ("5") di controllo, in coerenza con il 40% neuroprotezione. Tuttavia, se un formato tradizionale mediante rapporti (ad esempio, lesioni / ferite massima) è usato, nessuna protezione è evidente [cioè, (5 / 10) = 50% per finta v. (3 / 6) = 50% a freddo precondizionamento ].

Figura 4
Figura 4. Typial risultato qPCR sono mostrati. Superiore curva numero di copie di RNA v. ciclo soglia per l'amplificazione PCR mostrando controlli (blu) e dei campioni sperimentali (rosso). Abbassare immagine mostra profili di amplificazione tipica per quattro campioni (nero, verde, giallo e viola). Si noti il ​​secondo cicli soglia Ct (segnato da linea arancione) si verificano a 26,0, 29,5, 31,0, e 32,5.

Figura 5
Figura 5. Doppia etichetta immunocolorazione usata per confermare qPCR e risultati serie qPCR Una cultura fetta è stato elaborato per IL-11 (rosso) e NeuN (verde, per marcare i neuroni). Sondare per i loci espressione cellulare di IL-11. Notate che alcuni neuroni piramidali (frecce) mostrano IL-11 e la colorazione NeuN (giallo), mentre poche cellule più piccole (frecce), presumibilmente astrociti, mostra solo un aumento IL-11 colorazione (rosso).

Discussion

Due concetti di fondamentale importanza importante per delineare il sistema di segnalazione delle citochine coinvolte nel freddo precondizionamento neuroprotezione sono illustrati nelle figure 6 e 7. In primo luogo, le citochine sono estremamente basse concentrazioni delle molecole di segnalazione nel cervello normale. Tuttavia, i cambiamenti fisiologici concentrazione delle citochine hanno un immenso potenziale di alterare la struttura del cervello e della funzione (ad esempio, fenotipo) a causa della loro capacità di alterare l'espressione genica (Figura 6). Inoltre, le citochine sono altamente ridondanti e pleiotropici in più che le citochine possono avere effetti simili e una citochina singolo può avere diversi effetti (Figura 7). Quindi, per stabilire con precisione l'innata citochine basi per la neuroprotezione da freddo precondizionamento (o altri stimoli fisiologici precondizionamento), un'analisi composita di variabili relative segnalazioni devono essere determinati. Questo si realizza attraverso strategie di test multiplex. Questo stabilirà la "firma" di citochine freddo precondizionamento neuroprotezione.

Figura 6
Figura 6. Potere di segnalazione al cervello citochine. Le illustrazioni trasmettere l'immenso potere di segnalazione di concentrazioni fisiologiche di citochine cervello rispetto alle concentrazioni di altri ben riconosciuto controparti. La concentrazione è rappresentato come l'inverso della distanza, iniziando con un baffo di gatto solo come punto di riferimento. Di sodio (10 -1 M illustrato da un grano di pepe) e potassio (10 m -3 illustrato da un pomodoro) sono presenti nello spazio interstiziale del cervello a livelli di circa 150 e di 3 mm, rispettivamente, e sono ben noti i ruoli in la funzione delle cellule neurali elettrofisiologiche. Allo stesso modo, il pH (ad esempio, ~ 10 -7 M livelli di ioni di idrogeno e illustrato come 780 metri lungo il lungolago di Chicago) e calcio (per esempio, ~ 10 -8 M mostrato come i livelli di 7,8 km visto da un'immagine satellitare di Google lungo il lungolago di Chicago da McCormick Luogo di Promontory Point a Hyde Park vicino l'Università di Chicago). Inoltre, i neurotrasmettitori liberati nello spazio interstiziale su queste concentrazioni locali di influenzare l'attività regione del cervello. Al contrario, le citochine (mostrato come la distanza dalla Terra a Marte) può alterare la funzione del cervello a concentrazioni più di dieci milioni di volte di meno.

Figura 7
Figura 7. Segnalazione di percorsi interattivi citochine innate. Citochine sono altamente ridondanti e pleiotropici in più che le citochine possono avere effetti simili e una citochina singolo può avere diversi effetti. Tale diversità deriva dal complesso di segnalazione interattivo che avviene a livello di ligandi, recettori e fosfoproteine. Ulteriore complessità deriva dal fatto che il cervello è costituito da diversi tipi di cellule, ognuna capace di cellule specifiche citochine innate, recettori e cambiamenti fosfoproteina correlati. Per scopi illustrativi qui, solo citochine innata vie di segnalazione (derivati ​​da studi sulle cellule immunitarie) sono mostrati. Per semplicità, il cervello è disegnata come una singola cellula (linea bianca) che mostra le interazioni innato potenziale di citochine (IL-1α e IL-1β (di cui qui come IL-1α / β), TNF-α, IL-6, IFN-γ e IL-10), i recettori (IL-1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR, e IL-10R), e fosfoproteine ​​(cioè chinasi ERK1 / 2, P38 (P38-MAPK) e JNK) e fattori di trascrizione (ATF-2, NFκB e STAT3). Per esempio, il TNF-α segnali via TNFR1 di JNK, p38-MAPK e ERK1 / 2, che attiva l'espressione genica tramite ATF-2. TNF-α altera anche l'espressione genica direttamente attraverso l'attivazione NFκB. Insieme, l'attivazione di questi fattori di trascrizione evocano un aumento (freccia) e diminuito (punta smussata) espressione di citochine e loro recettori come indicato. È importante sottolineare che queste vie mostrano che i cambiamenti in una citochina (ad esempio, TNF-α) influenza la produzione di altri (ad esempio, IL-1β) citochine. Quindi, per stabilire con precisione la citochina basi per la neuroprotezione da freddo precondizionamento, un'analisi composita di variabili legate segnalazione deve essere determinato. Questo stabilirà la innata citochine "firma" di freddo precondizionamento. (Immagine è stato compilato a partire dai dati di riferimento # 25.)

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dalle concessioni dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke (NS-19.108), la Fondazione di Ricerca Emicrania, e la Fondazione Bianca per Richard P. Kraig. La signora Marcia P. Kraig assistito nella preparazione dei terreni di coltura e manutenzione di culture fetta. Ringraziamo Yelena Grinberg per i suoi commenti e revisioni su una versione finale di questo articolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Preparation of Slice Cultures
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) PICM0-3050
Basal Medium Eagle 21010
Earle s Balanced Salt Solution E2888
Horse serum 26050-088
Glutamax 35050
Gentamicin 15710-064
Fungizone 15295
D-glucose G8769
BSL-1 fume hood
McIlwain tissue chopper
Teflon disks 023-49-310-1
Spatula 14-373-25A
Curved iris scissors 14091-09
Long straight scissors 14002-14
Long forceps 13-812-40
Angled forceps 11808-02
Short forceps 13-812-38
#5 Inox forceps 11254-20
2 Iris spatulae 10094-13
150 x 15 mm Petri dishes 08-757-148
60 x 15 mm Petri dishes 08-757-100B
Wild M8 stereomicroscope
Gey s balance salt solution G9779
Blak-Ray shortwave Ultraviolet measuring meter J-225
6-well Falcon culture dishes 08-772-1B
Neurobasal 21103
B27 supplement 17504
Gem21 Neuroplex 400-160-010
Ascorbic acid A4544
CO2 Analyzer #2820
Pre-screening for Vitality of Slice Cultures
Sytox Green S7020
DMIBRE inverted microscope
Cold-Preconditioning
BSL-2 Fume Hood
Excitotoxic Injury
CoolSnap fx CCD camera
Fluoroscein F36915
MetaMorph software v. 7.5.04
100 μm deep hemacytometer
N-methyl-D-aspartate 454575
SigmaStat software v. 3.5
Co-treatments applied with Cold-Preconditioning
sTNFR1 425-R1-050
Bovine Serum Albumin A-4503
RNA Isolation
RNAlater AM7021
Micro RNEasy Kit 74004
β-mercapt–thanol 03446-100
Diposable 1.5 RNAse-free Pestle 749521-1590
RNasin N261A
Tris[hydroxymethyl]aminomethane T3069
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt hydrate #E7889
RNA Quantification
RiboGreen Assay R11491
Yeast tRNA 15401-011
1.5 mL centrifuge tubes 16155500
96-well fluorescent assay plate DK-4000
96-well fluorescent plate reader Safire II
Quantitative PCR
iScript reverse transcription kit 170-8891
SYBR Green S7563
Platinum Taq polymerase RNA Ultrasense 11732-927
iCycler thermocycler iCycler Optical Module
iCycler system software v. 3.1
Quantitative PCR for Microarrays
RNase Away #7000
RT2 First Strand Kit C-03
SYBR Green-based PCR mix Specific for iCycler PA-011
RT2 Profiler PCR Array PARN-011A
Proteomic Assay
Cell lysis kit 171-304011
Microcentrifuge Micro 7
BSA protein stock 500-0007
BCA protein assay kit 23225
Immuno 96 MicroWell plates 449824
Sealing tape 2239444
96-well plate reader 1420-mulilabel counter
Bioplex Rat TNF-α cytokine assay X0000001T
Immunostaining
16% Paraformaldehyde 43368
Lysine L-6001
Sodium phosphate S374-1
Sodium periodate S-1878
Sodium azide S-2002
Hydrogen Peroxide (30%) H1009
Goat serum CS 0920
Triton X-100 T-8787
Staining dishes 14511
Plate Shaker 3520
#1 Filter Papers (185 mm) 1001-185
3,3 -diaminobenzidine D8001
Dimethyl sulfoxide D8418
Ethanol 111000200
Xylene X3S-4
Permount mounting media SP15-100
Cryostat cm3050 S
Tissue-Tek 27050
Fine-tip paint brush 11806
PAP blocking pen 22309
SFX signal enhancer A31631
ProLong Antifade P7481

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References

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Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning. J. Vis. Exp. (43), e2192, doi:10.3791/2192 (2010).

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