Summary
Corneal konfokale Mikroskopie ist eine nicht-invasive klinische Technik, die zur C-Faser Schäden quantifizieren zu diagnostizieren und zu schichten Patienten mit zunehmender Schwere neuropathischen werden kann.
Abstract
Die genaue Quantifizierung der peripheren Neuropathie ist wichtig, Risikopatienten zu definieren, zu antizipieren Verschlechterung und Bewertung neuer Therapien. Herkömmliche Methoden zur Bewertung neurologischer Defizite und Elektrophysiologie und quantitative sensorische Testung quantifiziert funktionellen Veränderungen auf Neuropathie erkennen. Allerdings scheint die früheste Schäden an den kleinen Fasern werden und doch sind diese Tests in erster Linie zu beurteilen großen Faser Dysfunktion und haben eine begrenzte Fähigkeit zur Regeneration und Reparatur zu demonstrieren. Das einzige Verfahren, die eine direkte Untersuchung von marklosen Nervenfasern Schädigung und-Reparatur ermöglichen, sind N. suralis mit Elektronenmikroskopie und Haut-Stanzbiopsie Biopsie. Allerdings sind sowohl invasive Verfahren und erfordern langwierige Laborverfahren und erheblichen Know-how. Corneal konfokale Mikroskopie ist eine nicht-invasive klinische Technik, die in-vivo-Bildgebung von Hornhaut Nervenfasern bietet. Wir haben frühzeitig Nervenschäden, die den Verlust von intraepidermalen Nervenfasern geht in Hautbiopsien zusammen mit Schichtung der neuropathischen Schwere und Reparatur nach Pankreas-Transplantation bei Patienten mit Diabetes nachgewiesen. Wir haben auch Nervenschäden bei idiopathischer kleine Faser Neuropathie und Fabry-Krankheit nachgewiesen.
Protocol
Einleitung:
Die genaue Quantifizierung der peripheren Neuropathie ist wichtig, Risikopatienten zu definieren, zu antizipieren Verschlechterung und Bewertung neuer Therapien. Herkömmliche Methoden zur Bewertung neurologischer Defizite und Elektrophysiologie und quantitative sensorische Testung quantifiziert funktionellen Veränderungen auf Neuropathie erkennen. Allerdings scheint die früheste Schäden an den kleinen Fasern werden und doch sind diese Tests in erster Linie zu beurteilen großen Faser Dysfunktion und haben eine begrenzte Fähigkeit zur Regeneration und Reparatur zu demonstrieren. Das einzige Verfahren, die eine direkte Untersuchung von marklosen Nervenfasern Schädigung und-Reparatur ermöglichen, sind N. suralis mit Elektronenmikroskopie und Haut-Stanzbiopsie Biopsie. Allerdings sind sowohl invasive Verfahren und erfordern langwierige Laborverfahren und erheblichen Know-how. Corneal konfokale Mikroskopie ist eine nicht-invasive klinische Technik, die in-vivo-Bildgebung von Hornhaut Nervenfasern bietet.
HRT III-Rostock Kornea Modul (RCM)
Handbuch der Betrieb
1. Vorbereitung der Kamera
Der erste Schritt in der Untersuchung mit HRT ist die Vorbereitung des Objektivs Spitze.
- Zuerst an der objektiven Röhre des Laser-Scanning-Kamera, stellen Sie die Brechung bis +12 Dioptrien und stellen Sie dann die Kamera auf die unterste Position.
- Tragen Sie eine große homogene, blasenfreie, erbsengroße, Tropfen von Carbomer auf der Linse Spitze.
- Entfernen eines TomoCap aus der sterilen Behälter und befestigen Sie die Linse mit Spitze, so dass das Gel ein Meniskus zwischen dem Objektiv und der Kappe bildet. Schieben Sie ihn so weit wie möglich über den Inhaber. Achten Sie darauf, nicht auf die Vorderseite des TomoCap bei der Montage zu berühren.
Abbildung 1. Vorbereitung des Objektivs Spitze (oben) Anwendung viscotear Gel (unten) Die Anwendung der TomoCap. - Bewegen Sie den Laser-Scanning-Kamera so weit nach hinten wie möglich an der Kamera befestigen.
- Die inneren und äußeren Oberfläche der TomoCap sowohl als heller Laser Reflexion erscheinen. Die Brennebene Einstellrad sollte so eingestellt, bis eine helle Reflexion beobachtet, was darauf hinweist, dass die Linse innerhalb der Vorderseite der Kappe ist fokussiert werden. Die Tiefe Wert in der Fokus-Position angezeigt sollte nun zwischen -150 und +150 &mgr; um betragen.
- Setzen Sie die Tiefe Einstellung auf Null.
Abbildung 2. Anpassung der Brennebene.
2. Vorbereitung des Patienten
Die Augen des Motivs werden anästhesiert mit einem Rückgang von 0,4% benoxinate Hydrochlorid und Carbomer ist auf der Vorderseite des Auges zur Schmierung verwendet.
Das Thema ist bequem, mit dem Kinn auf die Kinnstütze sitzt und gebeten, ihre Stirn fest gegen die Stirn bar.
Abbildung 3. Vorbereitung des Patienten
3. Ausrichten der Kamera
Es macht die Untersuchung einfacher, wenn Sie den Patienten auf der äußeren Fixierung Licht mit dem Auge nicht geprüft fix zu unterweisen. Die kompakte Größe des Mikroskops Kopf bedeutet, dass das Thema der kontralateralen Auge nicht verdeckt, so dass die Verwendung von Distanz-Ziele.
Abbildung 4. Objektiv der Hornhaut-Modul.
- Position der CCD-Kamera, so dass seine optische Achse senkrecht zur optischen Achse des Laser-Scanning-Kamera. Die Kamera sollte auf der rechten Patientenseite werden bei der Abbildung das rechte Auge und umgekehrt.
An dieser Stelle sollten Sie die Vorderseite des TomoCap in der Mitte des CCD-Kamera Live-Bild. - Bewegen Sie den Laser-Scanning-Kamera auf den Patienten, bis der Hornhaut des Patienten ist in einem Abstand von ca. 5 bis 10 mm aus dem TomoCap, dann bewegen Sie den Laser-Scanning-Kamera nach oben / unten und links / rechts mit dem schwarzen Knöpfe an der Kamera, bis die TomoCap positioniert ist, in der Mitte der Hornhaut des Patienten. In diesem Stadium können Sie überprüfen, dass das rote Laserlicht in der Mitte der Hornhaut und zur Feineinstellung, beachten Sie die Reflexion des Laserstrahls von der Hornhaut, die sichtbar in der CCD-Kamera Bild ist. Diese Reflexion muss genau treten an den vorderen Pol der Hornhaut.
Abbildung 5. Ausrichtung des Laserstrahls auf dem vorderen Pol der Hornhaut zu zentralen Hornhaut Bilder zu fassen. - Fragen Sie den Patienten, seine / ihre Augen so weit wie möglich zu öffnen. Bewegen Sie den Laser-Scanning-Kamera langsam nach vorne in Richtung des Patienten, bis der TomoCap Kontakte der Hornhaut des Patienten. Wenn es erforderlich istzur Korrektur der Position des Laser-Scanning-Kamera, dann bewegen Sie die Kamera weg von den Patienten zunächst nicht der Korrektur, verschieben Sie es dann wieder nach vorne, um die Hornhaut zu kontaktieren.
Abbildung 6. Demonstration der dünnen Gel-Brücke zwischen den TomoCap und der Hornhaut. - Minimaler Kontakt zwischen der Kamera und die Hornhaut ist genug. In eine optimale Anpassung wird eine dünne Gel-Brücke zwischen den TomoCap und der Hornhaut sichtbar auf der CCD-Kamera Live-Bild.
Wenn Sie die TomoCap drücken oder bewegen Sie die Hornhaut zu nah an die Kamera dann wird der Druck auf die Hornhaut mit einem abgeflachten Erscheinung in der Hornhaut mittels der CCD-Kamera Live-Bild zu sehen. Auch in den Bildern erhalten eine Linie zeigt den Druck, erscheint daher nicht zu viel Druck auf die Hornhaut. Sobald der Kontakt hergestellt wurde, bewegen sich nicht die Position des headrestto vermeiden Schiebe die Hornhaut auf der TomoCap.
Abbildung 7 (links) Darstellung eines straie aufgrund der Anwendung von Überdruck auf der Hornhaut durch die TomoCap;. (Rechts) Ein Bild mit normalem Aussehen ohne Überdruck.
4. Untersuchung des Patienten
Nach dem Sichtfeld gewählt worden ist, ist die HRT III Laser Kamera eingeschaltet und die Bildaufnahme erscheint auf dem Bildschirm. Verwenden Sie die CCD Bild, um die TomoCap und Laser-Licht auf der Hornhaut des Patienten positionieren. Die Untersuchung mit dem gewählten Modus kann dann begonnen werden.
Abbildung 8. Viewing-Modus auf dem Monitor während der Aufnahme von Bildern.
Die Art der Übernahme
In dem Abschnitt Modus wird ein einziges Bild erworben und jedes Mal, wenn Sie den Fußschalter gespeichert. Wir verwenden diesen Modus für die Aufnahme von Bildern aus der ganzen Schicht der Hornhaut einschließlich Bowman-Schicht in der Mitte der Hornhaut. Und dann nach der Aufnahme eine ausreichende Zahl von Bildern, kann man versuchen, den anderen Modi einschließlich Abfolge und Volumen.
Abbildung 9. Wahlweise mit Display für verschiedene Bildaufnahme-Modi.
Mit dem Sequence-Scan kann man eine Sequenz von bis zu 100 Bilder mit einer einstellbaren Frame-Rate zu erwerben. Sie können wählen, eine Frame-Rate zwischen 30 Bilder und 1 Bild pro Sekunde (fps) und basierend auf diesen Modus erlaubt es Ihnen, einen Film mit einer Dauer von 3 bis 100 Sekunden abrufen kann.
In Volume-Scan-Modus stellt die Kamera automatisch erwirbt eine Serie von 40 Bildern in Folge Fokusebenen. Eine Tiefe von 85 um mit dem "FOV 400 um" Feldlinse und die Brennweite zwischen zwei aufeinander folgenden Bildern gescannt werden etwa 2,1 mu m liegen.
Nach ein paar Scans der Fokusebene des Objektivs kann geändert werden, um die Tiefe einer Hornhaut-Zellschicht bezogen auf die Oberfläche der Hornhaut, indem die Epithelzellschicht in den Fokus und dann auf die Reset-Taste, um die Tiefe Wert auf 0 gesetzt zu messen.
Für den Zweck unserer vorliegenden Studie, so erhalten wir Bilder von der zentralen Hornhaut in verschiedenen Tiefen. Deshalb haben wir nicht bewegen Scanning-Laser-Kamera um die Hornhaut horizontal oder vertikal, wir haben nur vorwärts und rückwärts bewegen und die Aufnahmen aus allen Tiefen der Bowman-Schicht an der gleichen Stelle der Hornhaut. Der Abstand zwischen jedem Bild ist etwa 1 um, daher, wenn die Tiefe von Bowman ist 10 pm, werden wir 10 Bilder haben. Doch für die endgültige Analyse wählen wir Bilder mit einem Abstand von ca. 2-3 um zwischen ihnen.
Nach der Untersuchung abgeschlossen ist schalten Sie die Kamera ausschalten, indem Sie die Kamera-Taste in der Akquisition Fenster. Machen Sie dem Patienten bewusst, dass er oder sie sollte nicht reiben seine Augen, bis die örtliche Betäubung abgeklungen ist. Als Vorsichtsmaßnahme sollten Sie auf eine Spaltlampe Untersuchung der Hornhaut des Patienten nach der Untersuchung durchzuführen.
Entfernen Sie die TomoCap von der Kamera und entsorgen Sie es und dann reinigen Sie die Mikroskop-Objektiv mit einem Wattestäbchen mit destilliertem Wasser befeuchtet.
5. Die Analyse einer Prüfungskommission
a. Die Auswahl der Bilder
Zur Überprüfung und Analyse vorhandener Untersuchungen, müssen die entsprechenden Patientenakte (s) in der Datenbank ausgewählt werden. Das Bild Sichtfenster bietet einen Überblick über vorhandene Hornhaut Untersuchungen für das ausgewählte Patienten. Untersuchungen an verschiedenen Tagen durchgeführt werden in separaten Tabs Besuch gespeichert. Die drei verschiedenen Scan-Typen werden durch drei verschiedene Symbole in der HRT III Hornhaut Besuch auf der Registerkarte Bild Sichtfenster der Hei vertretendelberg Eye Explorer.
Zur Erfassung der Hornhaut Bild, doppelklicken Sie auf das entsprechende Bild klicken und die "Show"-Funktion öffnet sich folgendes Fenster:
Abbildung 10. Aller aufgenommenen Bilder nach Prüfung anzeigen.
Abbildung 11. Anzeige des ausgewählten Bildes vor dem Export mit CCD-Kamera Blick von Auge um eine korrekte Ausrichtung zu zeigen.
So exportieren Sie die entsprechenden Bilder für die weitere Analyse, klicken Sie auf "Export" in der Symbolleiste und wählen Sie dann den gewünschten Ordner, um die Bilder zu speichern.
Wir erhalten und die Aufnahmen aus allen Schichten der Hornhaut für jeden Patienten, sondern als der Schwerpunkt der Forschung ist auf Bowman-Schicht und der Hornhaut Nerven, werden nur die Bilder aus dieser Schicht analysiert werden. Wir wählen 5-6 Frames von Bowman-Schicht für jedes Fach in unterschiedlichen Tiefen der Hornhaut.
Abbildung 12. Anzeige aller Schichten der Hornhaut von einem gesunden Probanden.
Auf durchschnittlich 5-6 Frames von Bowman-Schicht in der Mitte der Hornhaut in verschiedenen Tiefen werden nach dem Zufallsprinzip für quantitative Messungen und Analysen ausgewählt.
b. Analyse von Bildern
Für die Analyse der Bilder von Bowman-Schicht der zentralen Hornhaut mit HRT III erfasst, verwenden wir eine spezielle Software, die innerhalb unserer Gruppe namens "CCM Image Analysis Tools V 0.6" entwickelt wurde.
Vier Haupt-Parameter für die Hornhaut Nerven sind mit dieser Software gemessen:
- Nervenfaser Dichte (NFD), die als die Zahl der Hauptnerven / Rahmen definiert ist.
- Nervenast Dichte (NBD) Anzahl der Hauptäste / Rahmen.
- Nerve Faserlänge (NFL), die die Gesamtlänge aller Nerven / Rahmen.
- Nervenfaser Tortuosität (NFT) des Hauptnerven / Rahmen.
Zum Öffnen CCM Bild, um die Datei zu gehen> öffnen.
- Sobald das Bild geladen ist, ist seine Größe und Art der Bildinformationen Box auf der obersten linken Seite der Systemsteuerung angezeigt.
- Der Standard-Maßstab ist in der Eingabezeile der Bildinformationen angezeigt. Wenn der Maßstab ist anders, ändern Sie die Nummer in der Eingabezeile.
- Zu Beginn der Analyse das Bild, wählen Sie die gewünschten Parameter aus der Metric Box in der rechten oberen Seite des Control Panels messen.
- Auf das Ergebnis am unteren Rand der Seite die Anzahl der NFD ist NBD in tatsächliche Zahl, NFL in mm und Schlängelung als Tortuosität Coefficient (TC) vorgestellt.
- Doch nach dem Export der Ergebnisse in eine Excel-Tabelle werden die Ergebnisse in keiner / mm 2 für NFD und NBD-und mm / mm 2 für NFL vorgestellt werden.
- Zu diesem Zweck nach Beendigung Messungen an Add-Messungen klicken, dann gehen Sie auf Datei> Speichern unter und öffnen Sie dann die gespeicherten Ergebnisse mit Excel.
Abbildung 13. Anzeige der Hornhaut Nerven Bild mit Tracing in Analyse-Tool mit "CCM Image Analysis Tool".
6. Repräsentative Ergebnisse:
Wir haben eine progressive Steigerung in der Hornhaut Nervendegeneration mit zunehmender Schwere der diabetischen Neuropathie 1 und frühen Nervenschäden bei Diabetikern, die den Verlust von intraepidermalen Nervenfasern in Hautbiopsien vorausgeht 2 zusammen mit Schichtung der neuropathischen Schwere und Reparatur nach Pankreas-transplantation 3 in Diabetes-Patienten. Gezeigt Wir haben auch Nervenschäden bei idiopathischer kleine Faser Neuropathie 4 und Morbus Fabry 5 nachgewiesen.
Abbildung 14. Corneal konfokale Mikroskopie Bilder mit HRT III der Hornhaut-Bowman-Schicht (a) Steuerung unterliegt im Vergleich zu (b) Patient mit Neuropathie und schwere Nervenschäden.
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Discussion
Corneal konfokale Mikroskopie (CCM) ist eine nichtinvasive klinische Verfahren, mit dem frühen Nervenschäden zu erkennen und zu quantifizieren kleine Faser Pathologie in peripheren Neuropathien einschließlich Diabetes, Morbus Fabry und idiopathische kleine Faser Neuropathien (ISFN) werden kann. Die unmittelbare klinische Bedeutung dieser Technik stellt einen großen Sprung nach vorn in Bezug auf unsere Fähigkeit zu diagnostizieren, zu folgen Progression und bewerten therapeutische Reaktion bei Patienten mit diabetischer Neuropathie und anderen peripheren Neuropathien und eine unmittelbare Auswirkung auf Behandlungsergebnisse haben.
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Disclosures
Figuren 4 bis 6: Mit freundlicher Genehmigung von Heidelberg Engineering
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Juvenile Diabetes Research Foundation International (gewähren 17-2008-1031) und die National Institutes of Health (Grant 1R01DK077903-01A1) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HRT III CCM Machine - The Rostock Cornea Module | Heidelberg Engineering | ||
| CCM image analysis software v0.6 | University of Manchester |
References
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