Summary
角膜共焦点顕微鏡は、増加する神経因性重症の患者を診断し、層別化するC線維の損傷を定量化するために使用できる非侵襲的な臨床技術です。
Abstract
末梢神経障害の正確な定量化は、リスクの高い患者で定義劣化を予測し、新たな治療法を評価することが重要です。従来の方法では、神経学的欠損と電気生理学を評価し、定量的感覚検査は神経障害を検出するための機能変化を定量化する。しかし、初期の被害は小さい繊維になると、まだこれらのテストは主に大規模な繊維の機能障害を評価し、再生と修復を実証するために限られた能力を持っているように見えます。無髄神経線維の損傷と修復の直接検査を可能にする唯一の技術は、電子顕微鏡と皮膚パンチ生検と生検腓腹神経です。しかし、両方は侵襲的な処置であり、長い実験手順とかなりの専門知識を必要とする。角膜共焦点顕微鏡は、角膜神経線維の in vivoイメージングを提供する非侵襲的な臨床技術です。我々は、神経因性重症度と糖尿病患者における修復以下の膵臓移植の層別化と一緒に皮膚生検で表皮内の神経線維の消失に先行する初期の神経の損傷を、実証している。我々はまた、特発性、小さな繊維の神経障害とファブリー病における神経損傷を示している。
Protocol
はじめに：
末梢神経障害の正確な定量化は、リスクの高い患者で定義劣化を予測し、新たな治療法を評価することが重要です。従来の方法では、神経学的欠損と電気生理学を評価し、定量的感覚検査は神経障害を検出するための機能変化を定量化する。しかし、初期の被害は小さい繊維になると、まだこれらのテストは主に大規模な繊維の機能障害を評価し、再生と修復を実証するために限られた能力を持っているように見えます。無髄神経線維の損傷と修復の直接検査を可能にする唯一の技術は、電子顕微鏡と皮膚パンチ生検と生検腓腹神経です。しかし、両方は侵襲的な処置であり、長い実験手順とかなりの専門知識を必要とする。角膜共焦点顕微鏡は、角膜神経線維の in vivoイメージングを提供する非侵襲的な臨床技術です。
HRT III -ロストック角膜モジュール（RCM）
操作の説明書
1。カメラの準備
HRTを使用して試験の初期段階では、対物レンズの先端の準備です。
- 最初のレーザースキャニングカメラの客観的なチューブで、+12ジオプトリーに屈折を設定し、最も低い位置にカメラを調整する。
- レンズ先端のViscotearsの大きい均質な、泡フリー、エンドウ豆サイズの、ドロップを適用します。
- その滅菌容器からTomoCapを削除し、ゲルは、対物レンズとキャップの間にメニスカスを形成するようにレンズの先端の上にマウントします。ホルダーを介して可能な限りそれを押してください。実装時のTomoCapの表面に触れないように注意してください。
TomoCapを適用viscotearゲルを適用する対物レンズの先端（上）（下）の図1。準備。 - カメラのマウントに限り後方できるだけレーザースキャニングカメラを移動します。
- TomoCapの内側と外側の表面は、両方の鮮やかなレーザーの反射として表示されます。明るい反射がレンズキャップの前面内に集中していることを示す、観察されるまで焦点面調整ホイールを調整する必要があります。フォーカス位置の表示に示すように深さの値は、現在-150μmおよび150μmの間である必要があります。
- ゼロに深さの設定をリセットします。
図2。焦点面の調整。
2。患者の準備
人物の目は0.4％benoxinate塩酸塩、及びViscotearsのドロップを使用して麻酔する潤滑のための目の前に使用されています。
被験者は顎の残り上あごで、快適に座って、額のバーにしっかりと自分のおでこを押すように求められます。
図3患者の準備
3。カメラの位置合わせ
あなたが目を検討されていないと、外側の固視灯を修正するために患者に指示する場合には検査が容易になります。顕微鏡ヘッドのコンパクトなサイズは、距離のターゲットの使用を可能にする、被験体の反対側の眼が隠されていないことを意味します。
図4角膜モジュールの対物レンズ。
- その光軸は、レーザースキャニングカメラの光軸に対して垂直に動作するようにCCDカメラを配置します。カメラは時のイメージング右眼とその逆の患者の右側に配置する必要があります。
この位置では、CCDカメラのライブ画像の中心にTomoCapの前面に表示されるはずです。 - TomoCapまで、患者の角膜がTomoCap 10から5 mm程度の距離になるまで、患者に向かってレーザースキャニングカメラを移動してから、アップ/ダウンレーザースキャンカメラを移動し、右カメラのマウントにある黒いノブを使用して/左患者の角膜の中心に位置しています。この段階では、赤色レーザー光は、角膜の中心になっていることを確認することができ、微調整のために、CCDカメラの画像に表示されている角膜、からレーザービームの反射を観察。この反射は、角膜の前極で正確に行う必要があります。
図5。角膜中心の画像をキャプチャするために角膜の前極にレーザー光のアライメント。 - できるだけ広く彼/彼女の目を開くために患者を求める。患者TomoCap接触するまで、患者の角膜に向かって徐々に転送するレーザースキャニングカメラを移動します。それが必要な場合レーザースキャニングカメラの位置を補正するため、その後修正を行うには、最初に患者からカメラを移動してから、角膜への連絡、再び前方に移動する。
図6。TomoCapと角膜の間に薄いゲルの橋のデモンストレーション。 - カメラと角膜の間の最小限の接触で十分です。最適な調整では、TomoCapと角膜の間に薄いゲルのブリッジは、CCDカメラのライブ画像上に表示されます。
あなたがカメラに近づきすぎて角膜をTomoCapを押すか、移動するなら、あなたは、CCDカメラのライブ映像を介して角膜のフラット化された外観と角膜への圧力が表示されます。また、画像内の圧力が表示されますので、そのため角膜にあまりプレッシャーを適用しない示す線を得た。いったん接続が確立されて、TomoCapで角膜をスライド避けるheadresttoの位置を移動しないでください。
図7（左）TomoCapによって角膜上に過剰な圧力の適用によりstraieの外観。。（右）過剰圧力のない通常の外観のイメージ。
4。患者の検査
ビューのフィールドが選択された後、HRT IIIレーザーカメラがオンになり、画像取得のウィンドウが画面に表示されます。患者の角膜にTomoCapとレーザー光の位置をCCDの画像を使用してください。選択されたモードを使用して検査はして開始することができる。
図8画像の取り込み中にモニタ上でモードを表示する。
買収のモード
節モードでは、単一のイメージは、フットスイッチを押すたびに取得し、格納されています。我々は、角膜の中心にあるボーマン層を含む全体の角質層から画像を取得するため、このモードを使用してください。して、画像の十分な数をキャプチャした後、一シーケンスと量を含めた他のモードを試すことができます。
図9。異なる画像取得モードの選択と表示。
シーケンスのスキャンと、1つは調整可能なフレームレートで最大100画像のシーケンスを取得することができます。あなたが30フレームと1秒あたり1フレーム（fps）の間にフレームレートを選択するとこのモードに基づいてできることは、3〜100秒の持続時間と一緒に映画を取得することができます。
ボリュームのスキャンモードでは、カメラが自動的に連続して焦点面で40一連の画像を取得。 85μmの合計深さは、2つの連続した画像間で"FOV400μmの"フィールドのレンズと焦点距離が約2.1ミクロンになるとスキャンすることができます。
fewスキャン後にレンズの焦点面が焦点に上皮細胞層をもたらすとし、0に深度値を設定するには、[リセット]ボタンをクリックすることで角膜の表面に相対的角膜細胞層の深さを測定するために変更することができます。
私たちの本研究の目的のために、我々は、異なる深さで中央の角膜からの画像を取得する。したがって、我々は水平方向または垂直方向に角膜の周りに走査レーザーカメラを移動していない、我々だけで行ったり来たりすると同じ角膜点でボーマン層のすべての深さから画像をキャプチャ。各画像間の距離は約1μmであり、ボーマンの深さが10μmの場合はそれゆえ、我々は10個の画像を持つことになります。しかし最終的な分析のために、我々は彼らの間に約2〜3μmの間隔で画像を選択します。
検査後に取得ウィンドウでカメラの電源ボタンをクリックしてカメラの電源をオフに完了しています。局所麻酔がオフに着用するまで、彼または彼女が彼または彼女の目をこすってはならないことを患者に認識させる。万一に備えて、検査後の患者の角膜のスリットランプ検査を実行することもできます。
カメラからTomoCapを削除し、それを破棄して、綿を顕微鏡のレンズを清掃綿棒に蒸留水で湿らせた。
5。試験の分析
A.フレームを選ぶ
既存の試験をレビューし、分析するために、適切な患者記録（s）は、データベースウィンドウで選択する必要があります。画像表示ウィンドウは、選択された患者のための既存の角膜の検査の概要を説明します。別の日に実行される検査は、別々の訪問のタブに格納されています。つの異なるスキャンタイプは、特の画像表示ウィンドウのHRT IIIの角膜の訪問のタブには、3種類のアイコンで表されますdelbergアイエクスプローラ。
角膜のイメージを調査し、適切な画像のアイコンをダブルクリックし、"表示"機能は、次のウィンドウを開きます。
図10。審査の後にすべての撮影画像の表示。
図11。正しいアラインメントを表示するために眼のCCDカメラのビューで、エクスポートの前に選択した画像の表示。
さらなる分析のために適切な画像をエクスポートするには、ツールバーの"エクスポート"をクリックして、画像を保存するフォルダを選択します。
我々が取得し、各患者のための角膜のすべての層からの画像をキャプチャするが、本研究の主な焦点として、ボーマン層、角膜神経上にある、この層からの画像だけが分析されます。我々は、角膜の異なる深さで各科目のボーマン層から5-6のフレームを選択します。
図12健常人からすべての角膜の層の表示。
平均的に異なる深さで角膜の中心にあるボーマン層5から6フレームは、定量的な測定と分析のために無作為に選択されています。
B.画像の分析
HRT IIIと中央の角膜のボーマン層から撮影した画像を解析するために、我々は"CCM画像解析ツールV 0.6"と呼ばれる我々のグループ内で開発されている特殊なソフトウェアを使用してください。
角膜神経のための4つの主要なパラメータは、このソフトウェアを使用して測定されています：
- 主な神経/フレームの数として定義されている神経線維の密度（NFD）。
- 主な支店/フレームの神経の枝の密度（NBD）数。
- すべての神経/フレームの全長である神経線維の長さ（NFL）。
- 主な神経/フレームの神経線維の蛇行（NFT）。
CCMの画像を開くには、ファイルにアクセスしてください>オープン。
- イメージがロードされると、そのサイズと種類は、コントロールパネルの左上手側の画像情報ボックスに表示されます。
- デフォルトのスケールは、画像情報の編集行に表示されます。規模が異なる場合は、編集行の数字を変更します。
- 画像の分析を開始するには、コントロールパネルの上部右側のメトリック]ボックスから測定したいパラメータを選択します。
- ページの下部に結果ボックスNFDの数で、NBDは、NFLは、屈曲係数（TC）としてmmと蛇行で、実際の数値で表示されます。
- しかし、Excelシートに結果をエクスポートした後、結果はNFDとNBDとmm / NFLはmm 2の無/ mm 2をで表示されます。
- 測定値の追加の測定値をクリックし終えた後に、この目的のために、次にExcelで保存された結果を開いて[名前を付けて保存>ファイルに移動し、。
図13。"CCMの画像解析ツール"を使って解析ツールでのトレースによる角膜神経の画像の表示。
6。代表的な結果：
我々は、糖尿病患者における膵臓移植3次の2一緒に神経因性重症度と修理の層別化による糖尿病性神経障害1および皮膚生検で表皮内の神経線維の消失の前に糖尿病の初期に神 経損傷の重症度の増加による角膜神経変性に増加プログレッシブを実証している。我々はまた、特発性に細いファイバ神経障害4とファブリー病5の神経の損傷を示している。
図14。角膜ボーマン層のHRT III神経障害、重度の神経損傷と（b）の患者と比較して（）コントロールの対象と角膜共焦点顕微鏡画像。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
角膜共焦点顕微鏡（CCM）は、初期の神経の損傷を検出し、糖尿病、ファブリー病と特発性に細いファイバ神経障害（ISFN）を含む末梢神経障害で小さな繊維病理を定量化するために使用される非侵襲的な臨床技術です。この手法の直接の臨床的影響は、診断、進行を追跡し、糖尿病性神経障害および他の末梢神経障害患者の治療反応を評価し、患者の予後に直接影響を与えるために我々の能力の面で大きな前進を表しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
図4 - 6：ハイデルベルクエンジニアリングの礼儀
Acknowledgments
この作品は、少年糖尿病研究財団国際（助成17-2008-1031）と国立衛生研究所（助成金1R01DK077903 - 01A1）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HRT III CCM Machine - The Rostock Cornea Module | Heidelberg Engineering | ||
| CCM image analysis software v0.6 | University of Manchester |
References
- Abbott, C. A., Kallinikos, P., Marshall, A., Finnigan, J., Morgan, P., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Test to Diagnose and Assess Progression of Human Diabetic Neuropathy. Diabetes Care. 33, 1792-1797 (2010).
- Quattrini, C., Tavakoli, M., Jeziorska, M., Kallinikos, P., Tesfaye, S., Marshall, A., Finnigan, J., Boulton, A. J. M., Efron, N., Malik, R. A. Surrogate Markers of Small Fiber Damage in Human Diabetic Neuropathy. Diabetes. 56, 2148-2154 (2007).
- Mehra, S., Tavakoli, M., Efron, N., Boulton, A. J. M., Augustine, T., Malik, R. A. Corneal Confocal Microscopy Detects Early Nerve Regeneration After Pancreas Transplantation in Patients with Type 1 Diabetes. Diabetes Care. 30, 2608-2612 (2007).
- Tavakoli, M., Marshall, A., Pitceathly, R., Fadavi, H., Gow, D., Roberts, M. E., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. Corneal confocal microscopy: A novel means to detect nerve fibre damage in patients with impaired glucose tolerance and idiopathic small fibre neuropathy. Experimental Neurology. 223, 245-250 (2010).
- Tavakoli, M., Marshall, A., Thompson, L., Kenny, M., Waldek, S., Efron, N., Malik, R. A. Corneal confocal microscopy: A novel technique to detect small-fibre neuropathy in patients with Fabry disease. Muscle & Nerve. 40, 976-984 (2009).
