Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Hornhinnan konfokalmikroskopi: En ny icke-invasiv teknik för att kvantifiera Små Fibre patologi i perifera neuropatier

Published: January 3, 2011 doi: 10.3791/2194
* These authors contributed equally

Summary

Hornhinnan konfokalmikroskopi är en icke-invasiv clinical teknik som kan användas för att kvantifiera C fiber skador att diagnostisera och stratifiera patienter med ökande neuropatisk svårighetsgrad.

Abstract

Den noggranna kvantifiering av perifer neuropati är viktigt att definiera riskpatienter, förutse försämringar och bedöma nya terapier. Konventionella metoder utvärdera neurologiska bortfall och elektrofysiologi och kvantitativa sensoriska test kvantifierar funktionella förändringar för att upptäcka neuropati. Dock verkar de tidigaste skador vara att de små fibrer och ändå dessa tester främst bedöma stora fibrer dysfunktion och har en begränsad förmåga att visa förnyelse och reparation. Den enda teknik som möjliggör en direkt undersökning av unmyelinated nervtråd skador och reparationer Sural nerv biopsi med elektronmikroskopi och hud-punch biopsi. Men båda är ingrepp och kräver långa laboratorieprocedurerna och stort kunnande. Hornhinnan konfokalmikroskopi är en icke-invasiv klinisk teknik som ger in-vivo avbildning av hornhinnan nervfibrer. Vi har visat tidiga nervskador, som föregår förlusten av intraepidermal nervtrådar i huden biopsier tillsammans med skiktning av neuropatisk svårighetsgrad och reparation efter pankreas-transplantation hos patienter med diabetes. Vi har också visat nervskador i idiopatisk små fibrer neuropati och Fabrys sjukdom.

Protocol

Inledning:

Den noggranna kvantifiering av perifer neuropati är viktigt att definiera riskpatienter, förutse försämringar och bedöma nya terapier. Konventionella metoder utvärdera neurologiska bortfall och elektrofysiologi och kvantitativa sensoriska test kvantifierar funktionella förändringar för att upptäcka neuropati. Dock verkar de tidigaste skador vara att de små fibrer och ändå dessa tester främst bedöma stora fibrer dysfunktion och har en begränsad förmåga att visa förnyelse och reparation. Den enda teknik som möjliggör en direkt undersökning av unmyelinated nervtråd skador och reparationer Sural nerv biopsi med elektronmikroskopi och hud-punch biopsi. Men båda är ingrepp och kräver långa laboratorieprocedurerna och stort kunnande. Hornhinnan konfokalmikroskopi är en icke-invasiv klinisk teknik som ger in-vivo avbildning av hornhinnan nervfibrer.

HRT III-Rostock hornhinnan Module (RCM)

Manuell av Operation

1. Beredning av kameran

Det första steget i undersökningen använder HRT är beredning av objektiv tips.

  1. Först i mål röret för laserskanning kameran, ställ in brytning till +12 dioptrier och justera sedan kameran till lägsta läget.
  2. Applicera en stor homogen, bubbla fritt, stora ärter, droppe Viscotears på linsen spetsen.
  3. Ta bort en TomoCap från den sterila behållaren och montera den över linsen spets så att gelen bildar en menisk mellan objektiv och den gemensamma jordbrukspolitiken. Skjut det så långt som möjligt över hållaren. Var noga med att inte vidröra framsidan av TomoCap under montering.
    Figur 1
    Figur 1. Beredning av objektiv spetsen (överst) tillämpa viscotear gel (nederst) Tillämpning av TomoCap.
  4. Flytta laserskanning kameran så långt bakåt som möjligt på kameran berget.
  5. Den inre och yttre yta TomoCap både framstå som en ljus laser reflektion. Fokalplanet justeringen hjulet bör justeras tills en ljus reflektion observeras vilket tyder på att linsen är fokuserad på framsidan av locket. Djupet värde som visas i fokus positionsbilden bör nu vara mellan -150 ìm och 150 ìm.
  6. Återställ djupinställning till noll.
    Figur 2
    Figur 2. Justering av fokalplanet.

2. Förbereda patienten

Motivets ögon är bedövas med hjälp av en nedgång på 0,4% benoxinate hydroklorid, och Viscotears används på framsidan av ögat för smörjning.
Ämnet sitter bekvämt, med hakan på hakan vila och bad att trycka sin panna hårt mot pannan bar.

Figur 3
Figur 3. Förbereda patienten

3. Rikta kameran

Det gör undersökningen lättare om du instruera patienten att fixa på den yttre fixeringen ljus med ögat inte granskas. Den kompakta storleken på mikroskop huvudet innebär att en persons kontralaterala ögat inte skyms, möjliggör användning av avståndet mål.

Figur 4
Figur 4. Objektiv av hornhinnan modulen.

  1. Placera CCD-kameran så att dess optiska axel är vinkelrät mot den optiska axeln för laserskanning kameran. Kameran ska vara på patientens högra sida när avbildning höger öga och vice versa.
    I detta läge bör du se den främre ytan av TomoCap i mitten av CCD-kameran live-bild.
  2. Flytta laserscanning kameran mot patienten tills patientens hornhinna är på ett avstånd av ca 5 till 10 mm från TomoCap, sedan flytta kameran laserskanning upp / ned och vänster / höger med svarta rattarna på kameran fästet tills TomoCap är placerad i centrum av patientens hornhinna. I detta skede kan du kontrollera att den röda laserljuset är i mitten av hornhinnan och för finjustering, observera reflektion av laserstrålen från hornhinnan, vilket syns i CCD-kameran bilden. Denna reflektion måste ske exakt vid den främre stolpen av hornhinnan.
    Figur 5
    Figur 5. Anpassning av laserstrålen på den främre stolpen av hornhinnan för att fånga centrala hornhinnan bilder.
  3. Be patienten att öppna hans / hennes ögon så bred som möjligt. Flytta kameran laserskanning långsamt framåt mot patienten tills TomoCap kontakter patientens hornhinna. Om det krävsatt rätta position laserskanning kameran, sedan flytta kameran bort från patienten först, göra korrigeringen, sedan flytta den framåt igen för att ta kontakt med hornhinnan.
    Figur 6
    Figur 6. Demonstration av tunna gelen bro mellan TomoCap och hornhinnan.
  4. Minimal kontakt mellan kameran och hornhinnan är tillräckligt. I en optimal justering, är en tunn gel bro mellan TomoCap och hornhinnan synlig på CCD-kameran live-bild.

Om du trycker på TomoCap eller flytta på hornhinnan för nära kameran kommer du se press på hornhinnan med en tillplattad utseende i hornhinnan via CCD-kameran live-bild. Även i de bilder som fått en linje som visar att trycket kommer att visas därför inte för mycket tryck på hornhinnan. När kontakt har etablerats, rör dig inte ställning headrestto undvika att skjuta hornhinnan på TomoCap.

Figur 7
Figur 7 (vänster) Utseende av en straie grund av tillämpningen av övertryck på hornhinnan som TomoCap,. (Till höger) En bild med normalt utseende utan övertryck.

4. Undersöka Patient

Efter synfältet har valts, är HRT III laser kameran slås på och bilden förvärvet visas på skärmen. Använd CCD-bild att placera TomoCap och laserljuset på patientens hornhinna. Undersökning med hjälp av det valda läget kan då påbörjas.

Figur 8
Figur 8. Kollar läget på skärmen när bilderna tas.

Läget för förvärvet

I avsnittet läget är en enda bild förvärvade och lagras varje gång du trycker på fotpedalen. Vi använder det här läget för att ta bilder från hela hornhinnan lagret inklusive Bowmans lager i mitten av hornhinnan. Och sedan efter att fånga tillräckligt många bilder, kan man prova andra lägen inklusive serie och volym.

Figur 9
Figur 9. Display med val för olika lägen bild förvärvet.

Med Sekvens scan, kan man få en sekvens av upp till 100 bilder med en justerbar bildfrekvens. Du kan välja en bildfrekvens mellan 30 ramar och en ram per sekund (fps) och utifrån detta läget det tillåter dig att skaffa en film med en löptid på 3 till 100 sekunder.

I volym skanningsläget förvärvar kameran automatiskt en serie av 40 bilder i följd fokalplan. Ett djup av 85 ìm kan skannas med "FOV 400 ìm"-fältet lins och brännvidd mellan två på varandra följande bilder kommer att vara cirka 2,1 ìm.

Efter några skannar fokus plan lins kan ändras för att mäta djupet i ett hornhinnan cellager i förhållande till hornhinnans yta genom att föra epitelceller skiktet i fokus och sedan klicka på knappen Återställ för att ställa in djupet värdet till 0.

För våra aktuella studien får vi bilder från den centrala hornhinnan på olika djup. Därför har vi inte flyttar scanning kameran runt hornhinnan horisontellt eller vertikalt, flytta vi bara bakåt och framåt och ta bilder från alla djup Bowmans lager på samma hornhinnan punkt. Avståndet mellan varje bild är ca 1 mikrometer, alltså om djupet av Bowmans är 10 mikrometer, kommer vi att ha 10 bilder. Men för slutlig analys, väljer vi bilder med ett avstånd av ca 2-3 ìm mellan dem.

När undersökningen är klar stänger av kameran genom att klicka på knappen kameran i förvärvet fönster. Gör patienten medveten om att han eller hon inte skulle gnida hans eller hennes ögon tills den lokala bedövningen. Som en försiktighetsåtgärd, kanske du vill göra en undersökning spaltlampa av patientens hornhinna efter undersökningen.

Ta bort TomoCap från kameran och kasta den och sedan rengöra mikroskop linsen med en bomullspinne fuktad med destillerat vatten.

5. Analysera ett Examination

A. Välja bilder

Att granska och analysera befintliga undersökningar, måste lämpliga patienten rad (er) väljas i databasen fönster. Bilden visar fönstret ger en översikt av befintliga hornhinna undersökningar för den valda patienten. Undersökningar utförda på olika dagar sparas i separata besök flikar. De tre olika skanna typer representeras av tre olika ikoner i HRT III hornhinnan besök flik av bilden fönstret av högskolandelberg Eye Explorer.

Att kartlägga hornhinnan bild, dubbelklicka på lämplig bild-ikonen och "Visa"-funktionen öppnar följande fönster:

Figur 10
Figur 10. Visning av alla tagna bilder efter undersökning.

Figur 11
Figur 11. Visning av vald bild före export med CCD-kamera bild av ögat för att visa rätt position.

För att exportera lämpliga bilder för vidare analys, klicka på "Exportera" i verktygsfältet och välj sedan den mapp du vill spara bilderna.

Vi får och ta bilder från alla skikt av hornhinnan för varje patient, men eftersom fokus för denna forskning är på Bowmans lager och hornhinnan nerver, kommer bara bilder från detta lager analyseras. Vi väljer 5-6 ramar från Bowmans lager för varje ämne på olika djup av hornhinnan.

Figur 12
Figur 12. Visning av alla hornhinnan lager från en frisk ämne.

I genomsnitt 5-6 ramar från Bowmans lager i mitten av hornhinnan på olika djup väljs slumpmässigt för kvantitativ mätning och analys.

b. Analysera bilder

För att analysera de bilder som tagits från Bowmans lager av de centrala hornhinnan med HRT III använder vi specialiserad mjukvara som har utvecklats inom vår grupp som kallas "CCM bildanalys Verktyg v 0,6".

Fyra viktiga parametrar för hornhinnan nerver mäts med denna programvara:

  • Nervtråd densitet (Nfd) som definieras som det antal huvudsakliga nerver / ram.
  • Nerve gren densitet (NBF) antal huvudgrenar / ram.
  • Nerve fiberlängd (NFL) som är den totala längden av alla nerver / ram.
  • Nervtråd tortuosity (NFT) av de viktigaste nerverna / ram.

För att öppna CCM bild, gå till Arkiv> Öppna.

  • När bilden är laddad, är dess storlek och typ som visas i bilden informationsrutan på det övre vänstra sida av kontrollpanelen.
  • Den förvalda skalan visas på redigera raden av bildinformation. Om skalan är annorlunda, ändra antalet på redigeringsraden.
  • Att börja analysera bilden, välja den parameter du vill mäta från Metric rutan i övre högra sidan av kontrollpanelen.
  • I resultatet längst ner på sidan antalet Nfd är NBD presenteras i faktiska antalet, NFL i mm och tortuosity som Tortuosity koefficient (TC).
  • Men efter att exportera resultatet till ett Excel-blad kommer resultaten att presenteras i något / mm 2 för Nfd och NBF och mm / mm 2 för NFL.
  • För detta ändamål efter avslutad mätning klicka på Lägg till mätningar, gå sedan till Arkiv> Spara som och öppna sedan den sparade resultat med Excel.

Figur 13
Figur 13. Visning av hornhinnan nerv bild med spårning i verktyg för analys med hjälp av "CCM Tool bildanalys".

6. Representativa resultat:

Vi har visat en progressiv ökar i hornhinnan sjukdomar i nervsystemet med ökande grad av diabetesneuropati 1 och början av nervskador vid diabetes som föregår förlusten av intraepidermal nervtrådar i huden biopsier 2 tillsammans med skiktning av neuropatisk svårighetsgrad och reparation efter pankreas transplantationen 3 hos diabetespatienter. Vi har också visat nervskador i idiopatisk små fibrer neuropati 4 och Fabrys sjukdom 5.

Figur 14
Figur 14. Hornhinnan konfokalmikroskopi bilder med HRT III i hornhinnan Bowmans lager (a) Kontroll föremål jämfört med (b) patient med neuropati och svåra nervskador.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hornhinnan konfokalmikroskopi (CCM) är en noninvasiv klinisk teknik som kan användas för att upptäcka tidiga nervskador och kvantifiera små fibrer patologi i perifera neuropatier inklusive diabetes, Fabrys sjukdom och idiopatisk små neuropatier fiber (ISFN). Den omedelbara kliniska betydelsen av denna teknik innebär ett stort steg framåt när det gäller vår förmåga att diagnostisera, följa utvecklingen och utvärdera terapeutisk respons hos patienter med diabetesneuropati och andra perifera neuropatier och kommer att ha en omedelbar effekt på patientens resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Figurerna 4 - 6: Courtesy of Heidelberg Engineering

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Juvenile Diabetes Research Foundation International (bidrag 17-2008-1031) och National Institutes of Health (bidrag 1R01DK077903-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HRT III CCM Machine - The Rostock Cornea Module Heidelberg Engineering
CCM image analysis software v0.6 University of Manchester

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, C. A., Kallinikos, P., Marshall, A., Finnigan, J., Morgan, P., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Test to Diagnose and Assess Progression of Human Diabetic Neuropathy. Diabetes Care. 33, 1792-1797 (2010).
  2. Quattrini, C., Tavakoli, M., Jeziorska, M., Kallinikos, P., Tesfaye, S., Marshall, A., Finnigan, J., Boulton, A. J. M., Efron, N., Malik, R. A. Surrogate Markers of Small Fiber Damage in Human Diabetic Neuropathy. Diabetes. 56, 2148-2154 (2007).
  3. Mehra, S., Tavakoli, M., Efron, N., Boulton, A. J. M., Augustine, T., Malik, R. A. Corneal Confocal Microscopy Detects Early Nerve Regeneration After Pancreas Transplantation in Patients with Type 1 Diabetes. Diabetes Care. 30, 2608-2612 (2007).
  4. Tavakoli, M., Marshall, A., Pitceathly, R., Fadavi, H., Gow, D., Roberts, M. E., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. Corneal confocal microscopy: A novel means to detect nerve fibre damage in patients with impaired glucose tolerance and idiopathic small fibre neuropathy. Experimental Neurology. 223, 245-250 (2010).
  5. Tavakoli, M., Marshall, A., Thompson, L., Kenny, M., Waldek, S., Efron, N., Malik, R. A. Corneal confocal microscopy: A novel technique to detect small-fibre neuropathy in patients with Fabry disease. Muscle & Nerve. 40, 976-984 (2009).

Tags

Medicin 47 korneal konfokalmikroskopi korneal nerver perifer neuropati diabetisk neuropati
Hornhinnan konfokalmikroskopi: En ny icke-invasiv teknik för att kvantifiera Små Fibre patologi i perifera neuropatier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tavakoli, M., Malik, R. A. CornealMore

Tavakoli, M., Malik, R. A. Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies. J. Vis. Exp. (47), e2194, doi:10.3791/2194 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter