Summary
مستعمرة تشكيل خلية (CFC) مقايسة هو فحص في المختبر الذي الأسلاف لدم شكل مستعمرات في وسط شبه صلبة. وتستخدم مجموعة من التشكل مستعمرة ، مورفولوجيا الخلايا ، والتدفق الخلوي لتقييم قدرة الأسلاف لتتكاثر والتفريق على طول الأنساب مختلفة للدم.
Abstract
وعادة ما يتم الحصول على الإنسان الجذعية المكونة للدم / السلف الخلايا من نخاع العظام ، دم الحبل السري ، أو الدم المحيطي وتستخدم لدراسة وleukemogenesis تكون الدم. لديهم القدرة على التمايز إلى الأنساب اللمفاوية والدم النخاعي. يستخدم مستعمرة تشكيل خلية (CFC) مقايسة لدراسة انتشار والتفريق بين نمط الأسلاف للدم من خلال قدرتها على شكل مستعمرات في المتوسط نصف صلبة. عدد والتشكل في المستعمرات التي تشكلها على عدد ثابت من الخلايا الإدخال توفير المعلومات الأولية حول قدرة الأسلاف للتمييز وتتكاثر. يمكن حصاده من مستعمرات الخلايا الفردية أو من لوحة كاملة لمواصلة تقييم أعدادهم والدول تمايز باستخدام التدفق الخلوي والتقييم من مورفولوجية بالغيمزا الملطخة الشرائح. هذا الاختبار هو مفيد لتقييم التمايز النخاعي اللمفاوية ولكن لا. يستخدم مصطلح النخاعي في هذا السياق بمفهومها الواسع ليشمل الأنساب المحببات ، الوحيدات ، محمر ، والنواءات.
وقد استخدمنا هذا الاختبار لتقييم آثار المسرطنة على تمايز الخلايا الأولية + CD34 الإنسان المستمدة من الدم المحيطي. لهذا الغرض هي الخلايا transduced مع بناء التحكم إما فيروسات أو بناء التعبير عن الجين الورمي من الفائدة ، في هذه الحالة ، NUP98 HOXA9. نحن نوظف متجه استخداما فيروسات ، MSCV - IRES - GFP ، أن يعبر عن مرنا bicistronic الجينات التي تنتج من الاهتمام وعلامة GFP. هي خلايا ما قبل تفعيلها من خلال تزايد في وجود السيتوكينات لمدة يومين قبل تنبيغ فيروسات. بعد يومين آخرين ، يتم عزل الخلايا GFP + الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS) ومختلطة مع methylcellulose المتوسطة التي تحتوي على نصف صلبة تستكمل مع السيتوكينات وحضنت المستعمرات حتى تظهر على السطح ، وعادة 14 يوما. يتم توثيق عدد والتشكل من المستعمرات. ثم تتم إزالة الخلايا من لوحات ، وغسلها ، عدها ، وتعرض للفحص التدفق الخلوي والمورفولوجية. التدفق الخلوي مع الاجسام المضادة المحددة لعلامات سطح الخلية التي أعرب عنها أثناء تكون الدم يوفر معلومات حول نسب ومرحلة النضج. الدراسات المورفولوجية الخلايا الفردية تحت المجهر بعد رايت تلوين غيمزا تقديم مزيد من المعلومات فيما يتعلق الانساب والنضج. transduced مقارنة مع خلايا مكافحة ناقلات الفارغة لتلك transduced مع الجين الورمي يكشف عن الآثار المترتبة على الجين الورمي على تمايز للدم.
Protocol
1. إعداد الكواشف
- إعداد الحلول العقيمة الأسهم 1000x من وزراء الخارجية ذات الصلة كيناز التيروزين 3 (FLT - 3) يجند ، محببة / بلعم مستعمرة عامل تحفيز (GM - CSF) ، الخلية الجذعية عامل (SCF) ، ثرومبوبويتين (TPO) ، انترلوكين (IL) -3 وIL - 6 وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحضير محلول معقم الأسهم Retronectin (1mg/ml) أيضا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تقسيم هذه الحلول في aliquots الأسهم الصغيرة والاحتفاظ في -20 درجة مئوية لتفادي تكرار تجميد ذوبان الجليد.
- إعداد FBS 2 ٪ في IMDM.
- إعداد الكامل المتوسطة IMDM بتركيزات النهائي FBS 20 ٪ ، 2 الجلوتامين مم ، 100 وحدة / مل البنسلين / الستبرتوميسين (PS). إضافة السيتوكينات التالية فقط قبل الاستخدام : 100 نانوغرام / مل FLT - 3 يجند ، 20 نانوغرام / مل GM - CSF ، و 100 نانوغرام / مل SCF ، 100 نانوغرام / مل TPO ، 50 نانوغرام / مل IL - 3 ، و 100 نانوغرام / مل IL - 6.
- إعداد جيش صرب البوسنة 1 ٪ في HBSS (كاليفورنيا والمغنيسيوم الحرة ، دون أحمر الفينول) و 2 ٪ في جيش صرب البوسنة D - PBS (الكالسيوم والمغنيسيوم الحرة). تعقيم الحلول التي تمر عبر مرشحات 0.22 ميكرون حقنة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد EDTA 0.02 ٪ في HBSS وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد غلفاني - pseudotyped الارتجاعي ترميز الحمض النووي لمصلحة وتخزينها في aliquots في -80 درجة مئوية. هذا الإجراء هو خارج نطاق هذه المقالة ، ولكن يوصف في مكان آخر (1-3).
لتلوين غيمزا
- قبل استخدام تصفية الحل رايت / بالغيمزا صمة مرتين من خلال ورقات 1 ميكرون تصفية في زجاجة نظيفة.
- على الفور قبل استخدامه ، وإعداد رايت / بالغيمزا العازلة درجة الحموضة 6.4 ، عن طريق خلط 50 مل من محلول رايت / بالغيمزا تصفية وصمة عار و 200 مل من محلول العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.4 -- جيوردانو الصيغة.
- إعداد الفوسفات حل العازلة ، 6.0 درجة الحموضة عن طريق إذابة 27.3 غرام من KH 2 ص 4 و 4.62 غرام من نا 2 هبو 4 في 3.5 O. 2 LH
- تحضير الميثانول بنسبة 50 ٪ في H 2 O.
2. PROCEDURE
وقبل ذوبان تنشيط الخلايا CD34 +
- أذاب قارورة من الخلايا المجمدة + CD34 بسرعة عند 37 درجة مئوية بحلول يهز بلطف حتى يتم ترك الماضي الكريستال الجليد الصغيرة ونقل التعليق الخلية (1 مل) إلى أنبوب مخروطي 50 مل. الشطف بلطف الخلايا المتبقية من القارورة مع 1 مل من درجة حرارة الغرفة 2 ٪ FBS / IMDM وإضافته إلى أنبوب 50 مل قطرة الحكيم بينما يحوم بلطف. الانتظار لمدة 3 دقائق. المقبل ، إضافة ببطء 2 مل من 2 ٪ FBS / IMDM ، في حين أن الاختلاط بلطف ، والانتظار لمدة 3 دقائق. كرر الإجراء بإضافة 2 ٪ FBS / IMDM هذا هو نفس حجم الخلية تعليق المخفف على فترات 3 دقائق ، في دوامات بلطف بين الإضافات ، حتى تصل إلى الحجم النهائي 32 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وإزالة طاف تاركين وراءهم نحو 0.5 مل.
- غسل بيليه من خلال تعليق في 20 FBS 2 ٪ مل / IMDM والطرد المركزي في 200 x ج لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة طاف ووقف الخلايا في المتوسط IMDM الكامل في حوالي 0.5 X 6 10 الخلايا / مل. يستغرق 10 ميكرولتر لتعليق الخلية إلى المزيج ، microtube مع نفس الحجم من محلول أزرق التريبان (0.4 ٪) وباستخدام عدد عدادة الكريات.
- تمييع الخلايا إلى خلايا ،1-،15 6 X 10 / مل بإضافة كاملة المتوسطة IMDM تستكمل مع السيتوكينات (انظر 1.3)
- ثقافة الخلايا في الحاضنة ترطيب 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 ل 2 يوما.
فيروسات تنبيغ بواسطة فيروس قبل التحميل
- يوم تنبيغ ، عد خلايا الفيروس قبل بدء تحميلها مسبقا لتحديد عدد الآبار التي سيتم إعدادها.
- تمييع الحل Retronectin الأسهم إلى 25 ميكروغرام / مل و 400 إضافة إلى كل ميكرولتر جيدا لمدة 24 غير المعالجة بشكل جيد نسيج لوحة الثقافة. احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في مجال السلامة الأحيائية هود الصفحي التدفق إلى معطف المسبق.
- إزالة الحل Retronectin وإضافة 400 ميكرولتر من 2 ٪ في جيش صرب البوسنة D - PBS إلى كل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تحسن الأسهم حلول الفيروس والحفاظ على الجليد. إزالة حل جيش صرب البوسنة ، إضافة 0.5 مل من إعداد الفيروس الى كل جيدا ، والطرد المركزي في XG 2200 عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- إزالة الفيروس من حل الآبار وكرر تحميل الفيروس وصفها في ثلاث مرات 2.10.
- شطف جيدا مع كل الباردة HBSS مل 0.5 (+ الكالسيوم والمغنيسيوم) أو IMDM.
- جمع قبل تنشيط خلايا + CD34 بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- Resuspend الخلايا في الخلايا ،1-،15 س 6 10 بنسبة 1.5 مل في المتوسط IMDM كاملة مع السيتوكينات.
- إضافة 1.5 مل تعليق على كل خلية بشكل جيد واحتضان في حاضنة ترطيب 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 ل 2 يوما.
transduced الفرز وجمع خلية من الخلايا
- ولكن بلطف تعليق بدقة الخلايا في أعلى لوحة فيروس محملةق والتصفية من خلال تصفية 50 ميكرومتر CellTrics الخلية في أنبوب مخروطي الشكل. يستغرق 10 ميكرولتر لتعليق الخلية إلى المزيج ، microtube مع حجم مساو من محلول أزرق التريبان والعد باستخدام عدادة الكريات. شطف جيدا مع كل 0.8 مل من EDTA 0.02 ٪ الباردة / HBSS (الكالسيوم والمغنيسيوم خالية دون الحمراء الفينول) وإضافة إلى أنبوب جمع نفسه من خلال تصفية 50 ميكرومتر CellTrics الخلية.
- الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية ، ويغسل مع بيليه HBSS الباردة (الكالسيوم والمغنيسيوم خالية دون الحمراء الفينول) عن طريق الطرد المركزي في 200 XG لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
- Resuspend الكرية 1 ٪ في جيش صرب البوسنة / HBSS (الكالسيوم والمغنيسيوم خالية دون الحمراء الفينول) إلى تركيز 15 X 10 مل / 6 أو حد أدنى لحجم 0.250 مل لفرز الخلايا. تبقي الخلايا على الجليد في الظلام. يعد أنبوب الباردة التي تحتوي على 20 ٪ FBS / IMDM / الجلوتامين / PS المتوسطة لجمع الخلايا التي تم فرزها. يتم إجراء الفرز في سرعة عالية كور فارز خلية من ألفين J. Siteman مركز السرطان في جامعة واشنطن في كلية الطب باستخدام عالية السرعة MoFlo فارز (داكو ، جلوستروب ، الدانمارك).
CFC مقايسة
- ذوبان الجليد على العدد المطلوب من 3 مل من وسائل الاعلام aliquots مقايسة CFC. دوامة بقوة لخلط والسماح للأنابيب الوقوف على الأقل 5 دقائق لتدع أي فقاعات الحالية لتطفو على السطح قبل إضافة الخلايا.
- للحصول على تركيز كل عينة الخلية لفرز وتقسيم عدد الخلايا التي يقدمها مرفق الفرز حسب حجم الخلية تعليق تقريبية. تأخذ الفيروسات transduced 3000 ، فرز الخلايا في microtube العقيمة التي تحتوي على 2 ٪ الباردة FBS / IMDM. قبل ضبط مستوى 2 ٪ FBS / IMDM ذلك أن حجم التعليق النهائي سيكون ما يقرب من 0.3 مل.
- تعليق الخلايا ونقل كامل الخلية 0.3 مل تعليق على قسامة 3 مل من GF Methocult + H4435 ، الذي يتألف من methylcellulose 1 ٪ ، 30 ٪ FBS ، BSA 1 ٪ ، 10 -4 M - 2 المركابتويثانول ، 2 مم L - الجلوتامين ، 50 نانوغرام / مل SCF ، 20 نانوغرام / مل GM - CSF 20 نانوغرام / مل IL - 3 و 20 نانوغرام / مل IL - 6 و 20 نانوغرام / مل G - CSF ، و 3 وحدة / مل في إرثروبويتين IMDM. ، الإنسان Methylcellulose اليورانيوم وسائل الإعلام (R & D الأنظمة) التي تتكون من methylcellulose 1.3 ٪ ، FBS 25 ٪ ، 1 ٪ BSA ، 5 × 10 -5 م 2 - المركابتويثانول ، 2 مم L - الجلوتامين ، و 50 نانوغرام / مل SCF ، 20 نانوغرام / مل GM - CSF ، و 20 نانوغرام / مل IL - 3 و 20 نانوغرام / مل IL - 6 ، يمكن أن يكون 20 نانوغرام / مل G - CSF ، والوحدات 3 / إرثروبويتين مل في IMDM تستخدم أيضا.
- دوامة بقوة لجعل الخليط تماما صعود وسقوط 3-4 مرات. ترك الأنبوب لا تزال قائمة لمدة 3 دقائق.
- إرفاق قياس 16 حادة في نهاية الإبرة إلى حقنة 3 مل ورسم بنسبة 2.2 مل. لا تضع فقاعات كبيرة ؛ طردهم في بداية طريق دفع بها بضع مرات. طرد 1.1 مل كل منهما 30 في صحن غير المعالجة ملم وانتشرت الخليط بالتساوي من قبل الدورية.
- مكان مكررة لوحات في لوحة 100 ملم مع طبق الماء الذي يحتوي على 3 مل من الماء المعقم. الثقافة لمدة 14 -- 17 يوم.
- توصيف ويسجل وفقا للمستعمرات التشكل مع مجهر مقلوب في التكبير 40X في صحن الثقافة ملحوظ مع شبكة التهديف. لأغراض الفحص لدينا ، وتصنف مستعمرات في 3 فئات : نقية محمر ، حيدي ، ومختلطة. انظر تعليمات الشركة الصانعة لsubclassification مستعمرة أخرى.
- قد يكون تفحص فحص كامل لوحة CFC بدون تكبير استخدام الماسح الضوئي المنتظم في 600 نقطة في البوصة ، والطاقة المنخفضة (40X) يمكن أن تؤخذ photomicrographs المستعمرات باستخدام مجهر مقلوب مزودة بكاميرا ملونة.
- لمزيد من التحليل للتمايز والانتشار ، ويتم استردادها من الخلايا لوحة CFC فحص كامل من خلال تعليق في عدة مجلدات من درجة حرارة الغرفة 2 ٪ FBS / IMDM. بعد الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية ، ومعلق الخلايا في 2 ٪ FBS / IMDM ، عدها ، وإما مع الأضداد الملون لالتدفق الخلوي أو نقلها إلى الشرائح باستخدام جهاز للطرد المركزي لتلطيخ Cytospin بالغيمزا.
تلوين الأجسام المضادة والتدفق الخلوي
- خلايا جهاز الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية في البرد وresuspend 50 ٪ مصل الفأر العادي في HBSS (الكالسيوم والمغنيسيوم خالية دون الحمراء الفينول).
- مكان ما يقرب من 5 × 10 5 خلايا في 80 ميكرولتر في أنبوب (12 X 75 مم الجولة القاع أنابيب) والحفاظ على الجليد. إضافة مزيج الأجسام المضادة (حوالي 20 ميكرولتر خليط أو سلبية حل لمراقبة أي ضوابط الضد) ومزيج من خلال استغلال طفيفة الأنابيب. إعداد أنابيب تحكم المعايرة مع عدم وجود أجسام مضادة أو مع الأضداد المضادة للCD45 لكل ملون تألقي. أنابيب مكان على الجليد في الظلام ، واحتضان لمدة 20 دقيقة. مزيج من خلال استغلال أنابيب طفيفة بعد 10 دقيقة الأولى. بعد دقائق و 20 حضانة ، وملء أنابيب مع HBSS الباردة وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية. Resuspend الكرية في البرد بارافورمالدهيد 0.5 ٪ / HBSS.
وعادة ما تستخدم في المخاليط التالية من الأجسام المضادة لتحليلنا. للتمايز النخاعي : CD11b (فيكوإيريترين - مترافق استنساخ ICRF44) / CD33 (allophycocyanin - مترافق استنساخ WM53) / CD45 (فيكوإيريترين - Cy7 - congjugated استنساخ HI30). محمر للتمايز : CD71 (فيكوإيريترين - M - مترافق استنساخ A712) / CD235a (allophycocyanin - مترافق استنساخ GA - R2) / CD45 (فيكوإيريترين - Cy7 - congjugated استنساخ HI30). - يتم تنفيذ التدفق الخلوي في صميم سرعة عالية فارز خلية من ألفين J. Siteman مركز السرطان في جامعة واشنطن في كلية الطب على تدفق عداد الكريات FACScan بالترقية إلى 5 ألوان واثنين من الليزر دينار بحريني (العلوم البيولوجية) ، وتحليلها باستخدام CellQuest دينار بحريني (العلوم البيولوجية) أو FlowJO v7.2.4 (شجرة نجمة ، وشركة ، آشلاند ، OR ، الولايات المتحدة الأمريكية) والبرمجيات.
تلوين غيمزا
- ووصف ما يقرب من 30000 الخلايا المستخرجة من لوحات مقايسة CFC أعلاه هي معلقة في 0.3 مل 2 ٪ FBS / IMDM ونقل إلى إحدى الشرائح باستخدام جهاز للطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة Cytospin لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد السفن التي تحتوي على تلطيخ nine الحلول في الترتيب التالي.
- المطلقة الميثانول
- رايت / بالغيمزا الأسهم الحل
- رايت / بالغيمزا العازلة ، ودرجة الحموضة 6.4
- 50 ٪ ميثانول في H 2 O
- H 2 O
- H 2 O
- العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.0
- H 2 O
- H 2 O
- الشرائح في مكان حاملة الشريحة وتراجع في الميثانول المطلقة (# 1) لمدة 2 دقيقة وصمة عار قبالة الميثانول الزائدة.
- على الفور ، وتراجع الناقل الشريحة في حل الأسهم رايت / بالغيمزا (# 2) لمدة 5 دقائق.
- نقل الناقل الى رايت / بالغيمزا العازلة ، ودرجة الحموضة 6.4 (# 3) ، واحتضان لمدة 10 دقيقة.
- تراجع الناقل مرتين في الميثانول بنسبة 50 ٪ (# 4) ، و 10 مرات في H 2 O (# 5) ، وآخر مرة في 10 H 2 O (# 6) ، ومن ثم 5 مرات في العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.0 (# 7) .
- نقل الناقل في H 2 O (# 8) ، واحتضان لمدة 2 دقيقة. تكرار الغسيل في H 2 O (رقم 9).
- السماح للشرائح في الهواء الجاف تماما في الناقل. إزالة كل شريحة ويمسح الجزء الخلفي من الشريحة مع الميثانول غارقة Kimwipes لإزالة البقع. وضع قطرة من Cytoseal 60 والزجاج غطاء لالختم.
- يتم تنفيذ عدد الفرق 500 خلية لكل شريحة بالغيمزا الملطخة باستخدام المجهر BX51 أوليمبوس. وتنقسم الخلايا في خمس فئات هي : خلايا بدائية تشمل التفجيرات وpromyelocytes ؛ خلايا الدم النخاعي والمتوسطة وتشمل myelocytes metamyelocytes ؛ خلايا الدم النخاعي ناضجة تشمل العصابات ، العدلات مجزأة ، وحيدات ، والضامة ؛ المتوسطة وتشمل الخلايا خلايا محمر مع hemoglobinization المتوسطة ، وتشمل خلايا ناضجة محمر الخلايا مع hemoglobinization الكامل. تؤخذ Photomicrographs مع كاميرا اوليمبوس DP71 مع هدف النفط 60x.
3.0) نتائج ممثلة :
- CFC مقايسة : بعض مدخلات السكان الخلية سوف تتكاثر ، والتفريق ، والمستعمرات على شكل شبه صلبة متوسطة خلال فترة الحضانة 14-17 يوما. في هذه التجربة ، فإنه من الواضح أن التعبير عن الجين الورمي NUP98 - HOXA9 تسببت في تشكيل حمراء بارزة (محمر المستعمرات) (الشكل 1) (3).
- يلطخ الأضداد والتدفق الخلوي : immunophenotyping تدفق cytometric من الخلايا التي تم جمعها من لوحات مقايسة CFC يوفر معلومات عن حالة التمايز من السكان الخلية. بواسطة الاستخدام المشترك للأجسام مضادة ضد بعض علامات التمايز ، يمكن تقييم نسب ودرجة نضوج الخلايا. في هذه الحالة كان يستخدم لتحديد الخلايا CD235a محمر. تسبب NUP98 - HOXA9 كما هو مبين في الشكل 2A ، بزيادة في نسبة الخلايا CD235a محمر + ، لكنه قلل من سطوع CD235a التعبير عن هذه الخلايا بالمقارنة مع الضوابط ، مشيرا إلى كبح نضوج محمر. 2B في الشكل ، يتم تحديد خلايا الدم النخاعي بحكم بالفيروس CD33 بهم. تسبب NUP98 - HOXA9 انخفاضا في عدد الخلايا + CD33 ، مع انخفاض في درجة وضوح التعبير CD11b ، بما يتفق مع كبح نضوج النخاعي (3). وبالتالي على النتائج التي تظهر التدفق الخلوي NUP98 - HOXA9 تسبب في تضخم محمر مع كبح نضوج كلا النخاعي ومحمر.
- تلوين غيمزا : دراسة مورفولوجية من الخلايا التي تم جمعها من لوحات مقايسة CFC معلومات عن الانساب ودرجة النضج من السكان الخلية. قد تم الحصول عليها شكليا الاستنتاجات تختلف عن تلك التي حصلنا عليها من الدراسات تدفق cytometric ، وبالتالي هذه الأساليب هي مكملة لبعضها البعض (3). يتم تكرار التجربة على الأقل 3 مرات ، وفي كل مرة يتم تنفيذ عدد الفرق 500 خلية للتمييز 5 فئات من الخلايا كما هو موضح أعلاه. وأوضح الأمثلة على هذه الخلايا في الشكل 3. يتم جدولتها على النتائج وتحليلها من أجل تحديد ما إذا كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين الجين الورمي - transduced عينة ومراقبة. في هذه الحالة ، أظهرت النتائج أن NUP98 - HOXA9 تسبب زيادة إجمالية في عددليالي من الخلايا ، مع تضخم محمر وتثبيط كل من محمر ونضوج النخاعي (3) (لا تظهر).
الشكل LEGENDS
الشكل 1 : آثار HOXA9 - NUP98 على التشكل CFC الإنسان.
وretrovirally الأولية الإنسان CD34 + الخلايا transduced إما مع سيطرة MSCV - IRES - GFP ناقلات أو ناقلات معربا عن NUP98 - HOXA9 ، وكان فرز الخلايا بالفيروس GFP. وكانت المصنفة الف الخلايا في كل من لوحين مكررة للمقايسة CFC وتكررت التجربة 3 4 مرات مستقلة. وتظهر لوحات تمثيلية بدون تكبير (يسار) وphotomicrographs منخفضة الطاقة من المستعمرات محمر ممثل (الحق) (3).
الشكل 2 : يبين التدفق الخلوي الابتدائي تعطيل CD34 + تمايز الخلايا البشرية التي HOXA9 - NUP98.
(أ) التدفق الخلوي للتمايز محمر : تم حصادها من لوحات خلايا CFC (انظر الشكل 1) والأجسام المضادة لملطخة CD45 وCD235a. وكان CD235a + تآمر على بوابة (اللوحة اليمنى) الرسم البياني لإظهار التعبير عن CD235a النسبي للخلايا التحكم (B) للتمايز الخلوي تدفق الدم النخاعي : تم حصادها من لوحات خلايا CFC وملطخة CD45 CD33 و. وكان CD33 + تآمر على بوابة الرسم البياني لإظهار التعبير CD11b مقارنة للتحكم (اللوحة اليمنى). وتظهر النسب المئوية للخلايا التي تدخل كل باب (3).
الشكل 3 : مورفولوجيا الخلايا اضطراب يظهر التمايز التي HOXA9 - NUP98 مقارنة مكافحة النواقل.
وأعدت لوحات من مسحات Cytospin CFC وملطخة بالغيمزا. وقد اتخذت Photomicrographs من الحقول مع ممثل هدفا النفط 60x. باء : الانفجار ؛ MM : النخاعي ناضجة ، IM : الوسيطة النخاعي ، ME : محمر ناضجة ، أي : وسيطة محمر (3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدم على نطاق واسع CFC مقايسة لتحديد أنماط انتشار والتفريق بين الأسلاف والمكونة للدم لدراسة آثار المسرطنة (4 ، 5). لها ميزة على الثقافات السائل من كونه مقايسة نسيلي ، ان هذه المستعمرات تمثل سلالة من سلف واحد ويمكن إزالتها بشكل فردي لمزيد من التحليل. الحد من مقايسة CFC هو أنه ليست كافية للكشف عن الأسلاف أو خلايا غير ناضجة أكثر الجذعية المكونة للدم ، ويتم الكشف عن استخدام مثل هذه الخلايا على المدى الطويل الثقافة الشروع في الخلية (LTC - IC) مقايسة (6 ، 7). وصف التجارب هنا تدل على أن الجين الورمي مكافحة غسل الأموال المرتبطة NUP98 - HOXA9 يمنع نضوج النخاعي ومحمر وأسباب تضخم محمر (1 ، 3).
منذ methylcellulose الثقافة المستندة نسبيا على المدى الطويل والمتوسط CFC لا يحتوي على المضادات الحيوية ، فإنه من الأهمية القصوى لمنع التلوث من الثقافات الخلية ، وخاصة أثناء وبعد الفرز. سوف أدنى تلوث جرثومية أو فطرية تطغى على الثقافة. تفسير التدفق الخلوي ومورفولوجية الخلية يتطلب خبرة ؛ ينصح بالتشاور مع الموظفين المدربين. وينبغي أن تستخدم فقط FBS الذي تم فرزهم لصلاحيتها للاستخدام مع الابتدائي الأسلاف النخاعي الإنسان ؛ يتم سرد المنتجات التي نستخدمها بشكل روتيني في الجدول الكواشف. Methylcellulose المستندة إلى وسائل الإعلام هي CFC لزج جدا ويجب توخي الحذر أثناء التعامل مع خاص لهم المزيج بالتساوي والقضاء على الفقاعات قبل تتدفق لوحات. إدراج طبق الماء مع لوحات CFC في أكبر لوحة من المهم لمنع جفاف المتوسط CFC أثناء حضانة طويلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر J. ألفين Siteman مركز السرطان في جامعة واشنطن في كلية الطب ومستشفى بارنز اليهودي في سانت لويس ، MO ، لاستخدام سرعة عالية كور فارز الخلية ، التي وفرت المعدات التدفق الخلوي وخدمات الفرز. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HL082549 وHL084179 K02 (NRY). ويدعم مركز للسرطان Siteman جزئيا عن طريق دعم مركز سرطان NCI P30 CA91842 المنحة.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Life Technologies | 12440 | |
| FBS | Stem Cell Technologies | 06150 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | |
| FLT-3 ligand | PeproTech Inc | 300-19 | |
| GM-CSF | PeproTech Inc | 300-03 | |
| SCF | PeproTech Inc | 300-07 | |
| TPO | PeproTech Inc | 300-18 | |
| IL3 | PeproTech Inc | 200-03 | |
| IL6 | PeproTech Inc | 200-06 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | |
| HBSS | Life Technologies | 14175 | |
| PBS | Life Technologies | 14200 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Methocult GF+ H4435 | Stem Cell Technologies | 04445 | |
| Human Methylcellulose Enriched Media | R&D Systems | HSC005 | |
| Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | |
| Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 8310 | |
| Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | |
| Anti-Human CD11b phyc–rythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | |
| Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | |
| Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | |
| Anti-Human CD71 phyc–rythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | |
| Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | |
| Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | |
| 24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | |
| 30 mm non-treated dish | Stem Cell Technologies | 27150 | |
| 100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Gridded scoring dishes | Stem Cell Technologies | 27500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | |
| Syringes 3 ml | Stem Cell Technologies | 28240 | |
| 16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | Stem Cell Technologies | 28110 | |
| 50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| TPX sample chambers | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A78710018 | |
| Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Shandon filter cards | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| Shandon cytospin slide holder | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 59920063 | |
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| 1 μm filter paper | VWR international | 28307-134 | |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Diaphot | |
| Microscope camera | Nikon Instruments | DS-F11 | |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
| Microscope camera | Olympus Corporation | DP71 | |
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | |
| Cytospin | Shandon, Inc. | Cytospin 2 | |
| Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | |
| Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
References
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , Forthcoming (2010).
- Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
- Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
- Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
- Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
- Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).
