Summary
估计周转率在海洋和淡水系统的病毒可以通过减少和再陷技术。这些数据使研究人员推断病毒介导的水生生态系统中的微生物死亡率。
Abstract
病毒是无孔不入的海洋和淡水系统的组成部分，是已知的微生物死亡率显着的代理商。发展的定量估计，这一过程是至关重要的，我们可以开发更好的模型的微生物群落结构和功能以及推进我们了解病毒如何工作，以改变水生生物地球化学循环。减少病毒技术可以让研究人员估计在病毒颗粒的释放速率从特有的微生物群落。总之，大量的自由（外）病毒是减少样品中，而维持在附近的环境浓度的微生物群落。没有免费的病毒和病毒再次出现在样品通过已被感染的社会成员的裂解epifluorescence显微镜可以通过量化，或在特定的病毒的情况下，定量率的微生物群落，然后孵育PCR扩增。然后，这些比率可以被用来估计微生物死亡，由于病毒介导的细胞溶解率。
Protocol
1。超滤海水生成“病毒”水（2001年威廉与Poorvin）
- 约20L的海水/ lakewater是为在无菌条件下尽可能收集。
- 水是连续预过滤通过142毫米直径的聚碳酸酯0.8微米的过滤器，保持社会分析，可在-20 ° C。更大的孔径过滤器可用于在此之前收获颇丰系统的步骤。
- 为了获得Amicon的M12系统（Millipore公司）30 kDa的截止螺旋墨盒是用来排除所有的病毒，即使是小RNA病毒的超滤水。
- 样品处理和集中〜25％的速度〜15-16千帕的背压。
- 余下的〜500毫升水样本将包含集中的病毒社区（可用于其他实验保存），而其余19.5无病毒水L将用于病毒性生产实验。
- Amicon的M12系统使用的每一天后，一定要清洗干净，以防止损坏滤芯膜。
- 如果你与海水的工作，至少Milli - Q水6L冲洗膜与0.1N的NaOH洗30-45分钟的解决方案遵循。
- 再次冲洗至少Milli - Q水6L硒鼓。
- 完成后，使用M12系统，螺旋墨盒应存放在一个0.05MH 3 PO 4溶液，在4 ° C 。
2。病毒病毒生产还原法（威廉等人 2002年）
- 高达500毫升的海水/ lakewater样品获得主机和病毒放置在一个sterifilter单元和0.2微米的标称孔径低蛋白结合过滤器（例如，Durapore）置于其上。
- 该样本是轻轻真空压力<200毫米汞柱，而不断resuspending样品用无菌移液管，抑制细菌细胞的过滤器上集中。
- 三卷超滤液慢慢地被添加到的菌悬液，免费病毒样本数量显着减少。
- 细菌分数稀释回无病毒水至500 ml，并分为三重复每次150毫升，并明确250毫升聚碳酸酯瓶。
3。切向流过滤（TFF）方法对病毒的生产（Weinbauer等 。2002年， 迪尔等人，2005年）
TFF病毒还原法的替代方法。
- 如上所述，约500毫升的天然样品收集。
- 这个范例是集中使用0.2微米孔径名义切向流过滤系统。
- 当细菌分数减少到大约10-15毫升，超滤，无病毒加水以上。
- 复制瓶培养在原位条件，使用环境试验箱。
- 使用筛选净蓝有色丙烯酸或丙烯酸减少光照强度，光照水平改变表面状况。
- 环境表面温度通常是通过使用一个流动海水甲板孵化器。
- 细菌和病毒的丰度估计的样品到离心管中添加的2.0-2.5％无菌戊二醛最终浓度在0时刻。这些样品立即用液氮速冻和储存冷冻，直到处理。
- 如果液氮不可用，可能是准备和显微镜幻灯片立即处理（参见下面的步骤）
- 子样本是由上面介绍的方法收集至少10小时，每隔2.5小时。
- 此时水可收集定量PCR分析。 5毫升的样品可能被添加到一个离心管，没有立即闪光冷冻在液氮中的固定液代理。
4。病毒生产显微镜（贵族和富尔曼1998年， 温家宝等人，2004年）
- 将0.02微米的过滤显微镜冷冻样品应在冰上解冻。
- 准备用无菌水稀释原液1:10原液的SYBR GREEN。接下来，从股票的解决方案，准备加入1ml至39毫升无菌水原液一个可行的解决方案。 50％甘油，50％的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS，0.05 mol娜2 HPO 4，0.85％氯化钠，pH值7.5）和2.5％的对苯二胺的新鲜原液也应准备开始之前。 50％glycerol/50％PBS液保持在4 ° C和P - phenylenediamINE股票在-20 ° C黑暗环境中，直到开始。右键过滤前添加苯二胺50％glycerol/50％的PBS作为抗淬灭的解决方案中使用的终浓度为0.1％。
- 将25毫米0.02微米，0.45微米MicronStep，纤维素支持过滤器的顶部Anodisc过滤。固定样本850μL加入到20的pKa Anodisc和真空顶部，直至完全干燥。将100μL的SYBR GREEN工作无菌培养皿中的解决方案，并与真空，小心取出过滤塔和SYBR GREEN Anodisc。样品在室温下孵育20分钟，在黑暗中。小心取出从SYBR绿色解决方案的过滤器和灯芯与一个Kimwipe过滤器的背面，清除所有残留的染料。如果需要，返回过滤塔，并通过800μL0.02 -微米的过滤水或无菌媒体，通过过滤器，冲洗掉多余的污渍。
- 小滴在显微镜幻灯片添加抗淬灭的解决方案，并放置顶盖上滑。取出盖玻片，干燥过滤器，并添加与抗淬灭溶液，在显微镜幻灯片湿。再次，添加少量的抗淬灭的解决方案，以盖玻片，慢慢地放置在过滤器顶部，一定要排除任何可能形成的泡沫。
- 立即冻结在-20 ° C的幻灯片，直到需要（这些应该在几个月内使用，以防止褪色和降低病毒计数）
- 病毒枚举使用一个全蓝色的过滤器设置（λ防爆= 450至490纳米，λEM抑制滤波器在λ= 510纳米= 510 nm处）的荧光显微镜（徕卡DMRXA显微镜）在我们的例子。每个滤波器将有至少20个领域的计算视图，确保量化每个字段电网总的病毒，以确保整个滤膜甚至病毒的分布。
- 平均的病毒再次发生率从三个独立的复制，然后计算和确定一个标准偏差是从生产速度。
5。代表性的成果
研究人员所收集的原始数据，需要最少的数学处理，生成病毒丰度的再次发生率。设置这项研究的主要数据是病毒丰度的再次发生率从孵化的子样本。这些结果形成独立的回归，每个样本的病毒丰度随时间。每个样本的个体孵化作为一个治疗，所以完成三个复制，孵化，研究者可以计算税率，以及估计的变化（如标准偏差）（参见图1。）
这个过程中需要注意的是，减少病毒丰度不变在宿主细胞样品中，携带病毒的负担减少。为了弥补这个损失，从源（未过滤海水或湖水）和T = 0的孵化样品的细菌数量的枚举是必要的。这些信息可以用来核算失去细胞的百分比：假设减少病毒丰度的过程中是没有选择性的微生物群落的任何成员或反对，这个因素可以被用来估计在病毒的原位生产速度。
图1。生产类病毒颗粒超过10小时的潜伏期 ，在使用epifluorescence显微镜原位条件。样品收集过程中浮游植物绽放2008年9月在新西兰海岸。
图2。这一过程始于生成无病毒水超滤水样化验病毒生产的工作流程过程的示意图。。这是使用超滤系统完成。在平行水样收集来自同一个站点，并通过一个过滤器的免费病毒而保留的微生物群落（含感染和非感染细胞的混合物）。这个社区是悬浮于病毒的自由水和就地条件下培养。然后监测病毒的再次发生率在未来10小时内，以确定病毒的生产率。
Discussion
一个病毒如何影响海洋微生物群落的重要组成部分的理解是，以确定该病毒粒子产生率。鉴于，在大多数系统中的丰度（或多或少）静态（威廉净重1999年，Weinbauer 2004年），以及病毒被删除或呈现非传染性迅速在水生系统（ 威廉等，1998），产率必须相对迅速，以取代失去颗粒。
估计死亡率病毒引起的微生物群落，需要多少病毒产生的每一次病毒裂解单元格（“突发大小”）的知识。天然样品中的病毒突发流量大小可以相差很大。脉冲大小，可直接通过透射电子显微镜（例如，Weinbauer Peduzzi 1994年）确定的，但往往超出这是一个给定的实验室的能力或不总是可行的。他们不能凭经验确定的情况下，24％病毒裂解事件的文学价值，可用于海洋生态系统和淡水生态系统的 34（帕拉达等。2006年）。如果这个数字除以病毒的生产速度，其结果是每量由每天的病毒破坏的细胞丰度。裂解价值的微生物可以分为由细菌病毒引起系统问题的死亡率造成的丰的常备现货：现有的估计范围从百分之几到几乎整个人口，往往依赖于系统问题的其他因素（威廉 - 马特森2008）。为了确定总死亡率的百分比，这个数字往往是乘以两个（假设50％的细胞去复制和50％的细胞失去了，Weinbauer 2004年）。
由于养分和微量元素的生物利用度（如氮，磷，铁），可以限制初级生产力的速度，如碳通量，通过水生生态系统，驱动的微生物病毒的死亡率在这个过程中作用的认识已成为海洋地球化学的兴趣。现在存在几个估计表明病毒释放一个重要的营养元素浓度每天的基础上，以水柱（ 罗等人，2008年， 希金斯等人，2009年），这些元素的微生物群落迅速吸收（Poorvin等人，2004年，Mioni 等人，2005年）。营养每单元（表示“配额”）的金额破坏细胞的数量乘以养分通量率的环境，才能确定。这些信息可以提供一个关键组成部分，我们如何微生物食物链的整个水生生态系统功能的理解。
涉及持续发展：通过了一系列的研究小组目前正在努力适应上述策略来枚举特定社区内的病毒，因此，以确定如何具体的生物体是由病毒活性的影响。要做到这一点的研究人员使用定量聚合酶链反应（qPCR的），估计在平行丰富的特定病毒的团体或家庭总病毒界的估计。结果，然后直接应用提供病毒的死亡率，营养的营业额，为特定的浮游生物群体等的估计。这种强大的新方法将在未来几年中，研究人员更深入地挖掘到与病毒生态相关的进程，并首次量化特定的病毒主机超越实验室系统的制约社区之间的相互作用。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这篇文章的发表，是由来自美国田纳西州大学的研究办公室授予。作者感谢上一代的学生和研究人员一直在努力改进这些程序。研究是由美国国家科学基金会（NSF - 0851113，NSF - 0825405和NSF - 0550485）的赠款支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% p-phenylenediamine | Acros Organics | 130575000 | Stock for Antifade |
| Amicon Proflux M12 system | EMD Millipore | N/A | Any ultrafiltration device may be used for this step |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Invitrogen | S-7563 | |
| Helicon S10 30kDa Filter | EMD Millipore | CDUF010LT | |
| Pelicon XL filters 0.22 μm | Fisher Scientific | PXGVPPC50 | |
| GE 0.2 μm PCTE membrane filters (47mm) | Fisher Scientific | 09-732-35 | |
| Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System | EMD Millipore | XX42LSS11 | Other TFF systems may be used for this step |
| 0.45 μm Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm) | Fisher Scientific | E04WP02500 | |
| GE Whatman 0.02 μm Anodisc filters (25mm) | Fisher Scientific | 68-09-6002 | |
| Leica DMRXA microscope | Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used | ||
| 20L polycarbonate carboys | Fisher Scientific | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5) | Fisher Scientific | BP329-500, S640-500 | |
| 50% Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G151-1 | |
| Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-71 | Any cryovials may be used |
| Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-74 | Any cryovials may be used |
| 85% H3PO4 | Fisher Scientific | A242-212 | Spiral Membrane storage |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-3 | M12 cleaning |
| Graduated Cylinders | |||
| Isopore 0.8-μm pore-size membrane filter (142mm) | EMD Millipore | ATTP14250 | |
| Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm) | Fisher Scientific | YY30 090 00 |
References
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