Summary
Le taux de rotation du virus dans les systèmes marins et d'eau douce peut être estimée par une réduction et la technique ne se reproduise. Les données permettent aux chercheurs de déduire les taux de mortalité microbienne virus de médiation dans les systèmes aquatiques.
Abstract
Les virus sont des éléments omniprésents des systèmes marins et d'eau douce, et sont connus pour être des agents significative de la mortalité microbienne. Développer des estimations quantitatives de ce processus est essentiel que nous pouvons alors développer de meilleurs modèles de la structure des communautés microbiennes et la fonction ainsi que progresser notre compréhension de comment les virus de travail pour modifier les cycles biogéochimiques aquatiques. La technique de réduction des virus permet aux chercheurs d'estimer la vitesse à laquelle les particules virales sont libérées de la communauté microbienne endémique. En bref, l'abondance de la libre (extracellulaire) virus est réduite dans un échantillon alors que la communauté microbienne est maintenue à la concentration ambiante proche. La communauté microbienne est ensuite incubée en l'absence de virus libre et la vitesse à laquelle virus se reproduisent dans l'échantillon (par le biais de la lyse des membres qui sont déjà infectés de la communauté) peut être quantifiée par microscopie à épifluorescence ou, dans le cas des virus spécifiques, quantitatifs PCR. Ces taux peuvent ensuite être utilisés pour estimer le taux de mortalité microbienne due à la lyse cellulaire médiée par le virus.
Protocol
1. L'ultrafiltration d'eau de mer pour générer des «virus-free" Eau (Wilhelm & Poorvin 2001)
- Environ 20L d'eau de mer / eau de lac est recueilli comme aseptiquement que possible.
- L'eau est en série préfiltrée par 142 mm de diamètre en polycarbonate 0,8 um filtres qui peuvent être conservés à -20 ° C pour l'analyse de la communauté. Agrandir la taille des pores des filtres peuvent être utilisés avant cette étape pour les systèmes très productifs.
- Pour obtenir de l'eau ultra filtrée à partir d'un système de Amicon M12 (Millipore) une cartouche 30 kDa spirale de coupure est utilisé pour exclure tous les virus, même de petits virus à ARN.
- Les échantillons sont traités et concentrés à la vitesse ~ ~ 25% avec 15 à 16 kPa de contre-pression.
- Le reste de l'échantillon de ~ 500 mL d'eau contiennent une communauté virus concentré (qui peuvent être sauvegardées pour d'autres expériences) alors que les autres 19,5 L de virus sans eau sera utilisée pour des essais de production virale.
- Après chaque journée d'utilisation, le M12 Amicon système doit être nettoyé pour éviter d'endommager la membrane de la cartouche filtrante.
- Si vous travaillez avec l'eau de mer, rincer la membrane avec moins de 6L eau Milli-Q suivie d'un lavage avec une solution de NaOH 0,1 N pendant 30-45 minutes.
- Encore une fois rincer la cartouche avec au moins 6L d'eau Milli-Q.
- Lorsque vous avez terminé l'utilisation du système M12, la cartouche en spirale doit être stocké dans un 0.05MH 3 PO 4 à 4 ° C.
2. Méthode de réduction des virus pour la production virale (Wilhelm et al. 2002)
- Jusqu'à 500 mL de l'échantillon d'eau de mer / eau de lac à la fois avec l'hôte et les virus est obtenue et placée dans une unité de sterifilter avec un 0,2-um nominale des pores de taille faible liaison aux protéines de filtre (par exemple, Durapore) placée sur elle.
- L'échantillon est délicatement à vide sous pression à <200 mmHg tout en continuant à remettre en suspension l'échantillon à l'aide d'une pipette de transfert stérile pour inhiber les cellules bactériennes de se concentrer sur le filtre.
- Lentement trois volumes d'ultrafiltrat sont ajoutés à la suspension bactérienne de réduire significativement le nombre de virus libre dans l'échantillon.
- La fraction bactérienne est diluée à 500 mL de retour avec le virus sans eau et divisée en trois répétitions de 150 ml chacun et sont placés dans des bouteilles en polycarbonate 250ml.
3. Tangentielle filtration à courant (FFT) Méthode pour la production virale (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005)
FFT représente une approche alternative à la méthode de réduction virale.
- Environ 500 ml d'échantillon naturel est recueilli comme décrit ci-dessus.
- Cet échantillon est concentrée en utilisant un 0,2-um nominale des pores de taille du système de filtration tangentielle débit.
- Lorsque la fraction bactérienne est réduite à environ 10-15 ml, ultrafiltré, sans virus, l'eau est ajoutée et distribués comme ci-dessus.
- Les bouteilles sont incubées à reproduire les conditions in situ en utilisant des chambres de l'environnement.
- Les niveaux d'éclairage sont modifiés pour les conditions de surface en utilisant l'acrylique bleuté clair avec acrylique ou de dépistage nette pour diminuer l'intensité lumineuse.
- Températures de surface ambiantes sont souvent obtenus en utilisant une eau de mer coule le pont d'incubateur.
- Les échantillons pour les estimations de l'abondance bactérienne et virale sont prises à l'instant 0 avec une concentration finale de glutaraldéhyde stériles 2,0-2,5% ajoutés dans des cryotubes. Ces échantillons sont immédiatement surgelés à l'azote liquide et conservés congelés jusqu'à leur transformation.
- Si l'azote liquide n'est pas disponible, lames de microscopie peuvent être préparées et traitées immédiatement (voir la procédure ci-dessous)
- Des sous-échantillons sont prélevés toutes les 2,5 heures pendant au moins 10 heures par la méthode décrite ci-dessus.
- A ce moment l'eau peuvent être prélevés pour l'analyse PCR quantitative. Jusqu'à 5 mL de l'échantillon peut être ajouté à un cryovial sans agent fixateur avec la congélation instantanée immédiate dans l'azote liquide.
4. Microscopie production virale (Noble & Fuhrman 1998, Wen et al. 2004)
- Les échantillons congelés à 0,02 um-filtrés pour la microscopie doivent être décongelées sur glace.
- Préparer une solution stock de SYBR Green en diluant la solution stock 1:10 avec de l'eau stérile. Ensuite, à partir de la solution mère, préparer une solution de travail en ajoutant 1 mL de la solution stock à 39 mL d'eau stérile. Un glycérol 50%, 50% de phosphate solutions salines tamponnées (PBS, 0,05 M Na 2 HPO 4, 0,85% de NaCl, pH 7,5) et une nouvelle solution stock de 2,5% de la p-phénylènediamine devrait également être préparée avant de commencer. Gardez la solution à 50% glycerol/50% de PBS à 4 ° C et le p-phenylenediamStock ine à -20 ° C dans l'obscurité jusqu'à ce départ. Juste avant de filtrage ajouter la p-phénylènediamine de la PBS 50% glycerol/50% à une concentration finale de 0,1% à être utilisé comme solution Antifade.
- Placez un filtre 25 mm Anodisc 0,02 um sur le sommet d'une MicronStep 0,45 um, filtre soutien cellulosique. Ajouter 850 uL de l'échantillon fixé sur le haut de la Anodisc et vide à 20 pKa jusqu'au séchage complet. Placer 100 ul de solution de travail SYBR Green à une boîte de Pétri stérile et, avec le vide encore, retirer délicatement le Anodisc de la tour de filtre et le placer sur le vert de SYBR. Incuber les échantillons dans l'obscurité à température ambiante pendant 20 minutes. Retirer soigneusement le filtre de la solution de SYBR Green et la mèche à l'arrière du filtre avec un Kimwipe pour supprimer tous les résidus de colorant. Si désiré, le retour du filtre à la tour et de passer jusqu'à 800 uL d'eau filtrée 0,02 um ou des médias à travers le filtre stérile à rincer excès de colorant.
- Ajouter une petite goutte de solution Antifade une lame de microscope et placer une lamelle sur le dessus. Retirer la lamelle et ajouter le filtre séché à la lame de microscope humides avec la solution Antifade. Encore une fois, ajoutez une petite quantité de solution à l'Antifade lamelle et lentement le placer sur le dessus du filtre, en veillant à se débarrasser de toutes les bulles qui peuvent se former.
- Geler immédiatement les diapositives à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire (elles devraient être utilisées dans quelques mois pour éviter la décoloration et abaissé compte virus)
- Les virus sont dénombrés à l'aide de microscopie par fluorescence (dans notre cas un microscope Leica DMRXA) avec un large éventail de filtre bleu (λ ex = 450 à 490 nm, λ em = 510 nm avec un filtre de suppression à λ = 510 nm). Chaque filtre aura au moins 20 champs de vue compté, en veillant à quantifier virus total de chaque grille de champ pour assurer une distribution de virus à travers la membrane du filtre.
- Taux en moyenne de réapparition du virus de l'indépendance trois répétitions sont alors calculées et un écart-type est déterminé à partir des taux de production.
5. Les résultats représentatifs
Les données brutes recueillies par le chercheur requiert un minimum de traitement mathématique pour générer des taux de réapparition de l'abondance du virus. L'ensemble de données primaires issues de cette étude est le taux de réapparition de l'abondance du virus dans les sous-échantillons à partir des incubations. Ces résultats sous forme de régressions indépendante du temps vs virus de l'abondance pour chacun des échantillons. Pour chaque échantillon, les incubations individuelles agissent comme un traitement, afin d'achever trois répliquent-incubations le chercheur peut calculer les taux ainsi que l'estimation de la variation (par exemple, l'écart-type) (voir figure 1).
Une mise en garde de ce processus est que la réduction de l'abondance du virus invariables conduit à une réduction dans les cellules hôtes dans l'échantillon qui ont la charge virale. Pour compenser cette perte, l'énumération de l'abondance bactérienne à la fois de la source (eau de mer non filtrée ou de l'eau du lac) et l'échantillon T = 0 d'incubation sont nécessaires. Cette information peut être utilisée pour comptabiliser le pourcentage de cellules perdues: en supposant que le processus de réduction de l'abondance du virus n'est pas sélectif pour ou contre des membres de la communauté microbienne, ce facteur peut alors être utilisée pour estimer le taux de production in situ de virus .
Figure 1. La production d'échantillons de virus-like particles sur une incubation de 10 heures à des conditions in situ en utilisant la microscopie à épifluorescence. Ont été recueillies lors d'un bloom phytoplanctonique au large des côtes de la Nouvelle-Zélande en Septembre 2008.
Figure 2. Schéma du processus de flux de travail pour le dosage de la production de virus. Le processus commence par l'ultrafiltration de l'eau pour générer de l'échantillon sans virus eau. Ceci est complété en utilisant un système d'ultrafiltration. Dans les échantillons d'eau parallèles sont collectées à partir du même site et les virus sans passé par un filtre alors que la communauté microbienne (contenant un mélange de cellules infectées et non infectées) est conservée. Cette communauté est alors remis en suspension dans l'eau contient aucun virus et incubés dans des conditions in situ. Le taux de réapparition de virus est ensuite contrôlée pour les 10 prochaines heures pour déterminer les taux de production du virus.
Discussion
Un élément essentiel dans l'influence de comprendre comment les virus communautés microbiennes marines est de déterminer la vitesse à laquelle particule virale sont produites. Étant donné que les abondances sont (plus ou moins) dans la plupart des systèmes statiques (Wilhelm & Suttle 1999, Weinbauer 2004), et que les virus sont supprimés ou rendus non infectieux plus rapidement dans les systèmes aquatiques (Wilhelm et al. 1998), puis les taux de production doit être relativement rapide pour remplacer les particules perdues.
L'estimation de la mortalité des virus cause à la communauté microbienne nécessite une connaissance de la façon dont de nombreux virus sont produits à chaque fois un virus lyse d'une cellule (la "taille de rafale"). Tailles irruption du virus dans des échantillons naturels peuvent varier considérablement. Tailles Burst peut être déterminée directement par microscopie électronique en transmission (par exemple, Weinbauer & Peduzzi 1994), mais cela est souvent au-delà des capacités d'un laboratoire donné ou pas toujours pratique. Dans les situations où ils ne peuvent pas être déterminée empiriquement, valeurs de la littérature de 24 virus par événement lytique peut être utilisé pour les systèmes marins et 34 pour les systèmes d'eau douce (Parada et al. 2006). Si le taux de production de virus est divisé par ce nombre, le résultat est l'abondance de cellules par volume détruit par un virus sur une base quotidienne. Les microbes lysées valeur peut alors être divisée par le stock permanent de l'abondance bactérienne résultant de la mortalité du virus induit pour le système en question: en vigueur les estimations vont de quelques pour cent à près de toute la population et sont souvent dépendants d'autres facteurs dans le système en question (Wilhelm & Matteson 2008). Pour déterminer le pourcentage de la mortalité totale ce nombre est souvent multiplié par deux (de travail de l'hypothèse que 50% des cellules passer à reproduire et à 50% des cellules sont perdues, Weinbauer 2004).
Étant donné que la biodisponibilité des nutriments et oligo-éléments (par exemple, N, P, Fe) peut limiter le taux de productivité primaire, et en tant que flux de carbone, par l'intermédiaire de systèmes aquatiques, et la compréhension du rôle de la mortalité microbienne virus conduit dans ce processus est devenu d'intérêt pour les géochimistes marins. Plusieurs estimations existent actuellement, qui suggèrent virus libérer une forte concentration d'éléments nutritifs vers la colonne d'eau sur une base quotidienne (Rowe et al. 2008, Higgins et al. 2009) et que ces éléments sont rapidement assimilés par la communauté microbienne (Poorvin et al. 2004, Mioni et al. 2005). Le taux de flux de nutriments dans l'environnement peut être déterminé en multipliant le nombre de cellules détruites par la quantité de nutriments par cellule (notée «quotas»). Cette information peut fournir un élément essentiel à notre compréhension de la façon dont les réseaux trophiques microbiens fonctionner à travers les systèmes aquatiques.
Les évolutions en cours: Les efforts actuels par une série de groupes de recherche concernent l'adaptation de la stratégie ci-dessus pour énumérer les virus spécifiques à l'intérieur de la communauté et, comme tels, afin de déterminer comment les organismes spécifiques sont influencées par l'activité des virus. Pour ce faire les chercheurs utilisent la réaction en chaîne polymérase quantitative (qPCR) pour estimer l'abondance des groupes de virus spécifiques ou des familles en parallèle pour les estimations de la communauté de virus total. Les résultats sont ensuite directement appliquées à fournir des estimations de la mortalité du virus, renouvellement des nutriments, etc pour les groupes planctoniques spécifiques. Cette approche nouvelle et puissante permettra aux chercheurs dans les prochaines années pour creuser plus profondément dans les processus liés à l'écologie du virus et, pour la première fois, de quantifier les interactions spécifiques du virus-hôte des communautés au-delà des contraintes des systèmes de laboratoire.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
La publication de cet article a été soutenu par une subvention du Bureau de la recherche à l'Université du Tennessee. Les auteurs remercient la génération précédente d'étudiants et de chercheurs qui ont travaillé à affiner ces procédures. La recherche a été soutenue par des subventions de la National Science Foundation (NSF-0851113, 0825405 et NSF NSF-0550485).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% p-phenylenediamine | Acros Organics | 130575000 | Stock for Antifade |
| Amicon Proflux M12 system | EMD Millipore | N/A | Any ultrafiltration device may be used for this step |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Invitrogen | S-7563 | |
| Helicon S10 30kDa Filter | EMD Millipore | CDUF010LT | |
| Pelicon XL filters 0.22 μm | Fisher Scientific | PXGVPPC50 | |
| GE 0.2 μm PCTE membrane filters (47mm) | Fisher Scientific | 09-732-35 | |
| Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System | EMD Millipore | XX42LSS11 | Other TFF systems may be used for this step |
| 0.45 μm Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm) | Fisher Scientific | E04WP02500 | |
| GE Whatman 0.02 μm Anodisc filters (25mm) | Fisher Scientific | 68-09-6002 | |
| Leica DMRXA microscope | Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used | ||
| 20L polycarbonate carboys | Fisher Scientific | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5) | Fisher Scientific | BP329-500, S640-500 | |
| 50% Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G151-1 | |
| Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-71 | Any cryovials may be used |
| Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-74 | Any cryovials may be used |
| 85% H3PO4 | Fisher Scientific | A242-212 | Spiral Membrane storage |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-3 | M12 cleaning |
| Graduated Cylinders | |||
| Isopore 0.8-μm pore-size membrane filter (142mm) | EMD Millipore | ATTP14250 | |
| Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm) | Fisher Scientific | YY30 090 00 |
References
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