Summary
समुद्री और मीठे पानी प्रणालियों में वायरस के कारोबार की दर एक कमी और reoccurrence तकनीक से अनुमान लगाया जा सकता है. डेटा शोधकर्ताओं वायरस की मध्यस्थता जलीय प्रणालियों में माइक्रोबियल मृत्यु की दर अनुमान करने के लिए अनुमति देते हैं.
Abstract
वायरस समुद्री और मीठे पानी प्रणालियों की व्यापक घटक हैं, और माइक्रोबियल मृत्यु का महत्वपूर्ण एजेंट हो जाता है. इस प्रक्रिया की मात्रात्मक अनुमान का विकास महत्वपूर्ण है के रूप में हम तो माइक्रोबियल समुदाय संरचना और समारोह के बेहतर मॉडल विकसित करने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कर सकते हैं कैसे वायरस के लिए जलीय biogeochemical चक्र बदल काम की हमारी समझ अग्रिम. वायरस कमी तकनीक शोधकर्ताओं दर है जिस पर वायरस कणों स्थानिकमारी वाले माइक्रोबियल समुदाय से जारी कर रहे हैं अनुमान करने के लिए अनुमति देता है. संक्षेप में, मुक्त वायरस (बाह्य) की बहुतायत एक नमूने में कम है जबकि माइक्रोबियल समुदाय के निकट परिवेश एकाग्रता में बनाए रखा है. माइक्रोबियल समुदाय तो मुक्त वायरस के अभाव और दर जिस पर वायरस के नमूने में reoccur (समुदाय के सदस्यों को पहले से ही संक्रमित के lysis के माध्यम से) epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है या विशिष्ट वायरस के मामले में, मात्रात्मक में incubated है पीसीआर. इन दरों तो माइक्रोबियल वायरस की मध्यस्थता सेल lysis के कारण मृत्यु की दर का अनुमान किया जा सकता है.
Protocol
1. समुद्र के पानी के ultrafiltration जल "वायरस मुक्त" (विल्हेम और Poorvin 2001) उत्पन्न
- समुद्री जल / lakewater के लगभग 20L aseptically के रूप में संभव के रूप में एकत्र किया जाता है.
- जल serially 142 मिमी व्यास polycarbonate के माध्यम से 0.8 सुक्ष्ममापी फिल्टर है कि समुदाय के विश्लेषण के लिए -20 ° सी में रखा जा सकता है है prefiltered है. बड़ा ध्यान में लीन होना आकार फिल्टर बहुत उत्पादक सिस्टम के लिए इस कदम से पहले इस्तेमाल किया जा सकता है.
- एक Amicon M12 (Millipore) प्रणाली, एक 30 सर्पिल केडीए cutoff कारतूस के लिए सभी वायरस को बाहर करने के लिए प्रयोग किया जाता है यहां तक कि छोटे आरएनए वायरस से ultrafiltered पानी प्राप्त करने के लिए.
- नमूने संसाधित कर रहे हैं ~ backpressure की 15-16 kPa के साथ ~ 25% की गति पर ध्यान केंद्रित.
- ~ पानी की 500 एमएल की शेष नमूना वायरस मुक्त पानी की शेष 19.5 एल वायरल उत्पादन assays के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, जबकि एक केंद्रित वायरस समुदाय (जो अन्य प्रयोगों के लिए बचाया जा सकता है है) हो जाएगा.
- उपयोग के प्रत्येक दिन के बाद, Amicon M12 प्रणाली फिल्टर कारतूस की झिल्ली को नुकसान को रोकने के साफ होना चाहिए.
- यदि आप समुद्री जल के साथ काम कर रहे हैं, झिल्ली कुल्ला मिल्ली क्यू पानी के कम से कम 6L साथ 0.1N 30-45 मिनट के लिए NaOH समाधान के साथ एक कपड़े धोने की के द्वारा पीछा किया.
- फिर कम से कम 6L मिल्ली - क्यू पानी के साथ कारतूस कुल्ला.
- जब M12 प्रणाली का उपयोग समाप्त, सर्पिल कारतूस 0.05MH 4 में तीन पीओ 4 समाधान डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किया जाना चाहिए
2. वायरस कमी वायरल उत्पादन के लिए विधि (विल्हेम एट अल 2002.)
- नमूना / lakewater समुद्री जल के दोनों मेजबान और वायरस प्राप्त है और एक 0.2-सुक्ष्ममापी नाममात्र रोमकूप आकार के प्रोटीन बाध्यकारी फिल्टर (जैसे, Durapore) पर रखा कम के साथ एक sterifilter इकाई में रखा के साथ 500 एमएल
- नमूना धीरे <200 mmHg दबाव निर्वात जबकि लगातार नमूना resuspending एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करने के लिए फ़िल्टर पर ध्यान केंद्रित से बैक्टीरियल कोशिकाओं को बाधित.
- धीरे धीरे ultrafiltrate के तीन खंडों जीवाणु निलंबन को जोड़ रहे हैं करने के लिए काफी नमूने में मुफ्त वायरस की संख्या कम हो.
- बैक्टीरियल अंश वापस 500 एमएल के लिए पतला है और वायरस मुक्त पानी के साथ तीन में विभाजित प्रत्येक 150 एमएल की प्रतिकृति और स्पष्ट 250ml polycarbonate बोतलों में रखा.
3. स्पर्शरेखा फ्लो वायरल उत्पादन के लिए निस्पंदन विधि (TFF) (Weinbauer एट अल 2002. Winget एट अल 2005)
TFF वायरल कमी विधि के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है.
- प्राकृतिक नमूने के लगभग 500 एमएल ऊपर वर्णित के रूप में एकत्र किया जाता है.
- यह नमूना एक 0.2-सुक्ष्ममापी नाममात्र ताकना आकार के स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन सिस्टम का उपयोग करने के लिए ध्यान केंद्रित किया है.
- जब जीवाणु अंश लगभग 10-15 एमएल कम है, ultrafiltered वायरस मुक्त, पानी जोड़ा है और इसके बाद के संस्करण के रूप में वितरित की है.
- को दोहराने के बोतलों सीटू पर्यावरण कक्षों का उपयोग कर शर्तों में incubated हैं.
- प्रकाश के स्तर को शुद्ध स्क्रीनिंग के साथ नीले रंग चढ़ाया हुआ एक्रिलिक या स्पष्ट ऐक्रेलिक का उपयोग करने के लिए प्रकाश की तीव्रता में कमी से सतह शर्तों करने के लिए बदल रहे हैं.
- परिवेश सतह के तापमान अक्सर एक बह समुद्री जल डेक इनक्यूबेटर का उपयोग करके प्राप्त कर रहे हैं.
- बैक्टीरियल और वायरल बहुतायत अनुमान के लिए नमूने 0 समय में 2.0-2.5% बाँझ glutaraldehyde की एक अंतिम एकाग्रता cryovials में जोडी के साथ लिया जाता है. इन नमूनों को तुरंत तरल नाइट्रोजन के साथ जमे हुए फ़्लैश और संग्रहित जमे हुए है जब तक संसाधित.
- यदि तरल नाइट्रोजन उपलब्ध नहीं है, माइक्रोस्कोपी स्लाइड तैयार किया जा सकता है तुरंत संसाधित हैं (नीचे प्रक्रिया देखें)
- Subsamples ऊपर वर्णित विधि द्वारा कम से कम 10 घंटे के लिए हर 2.5 घंटे में एकत्र कर रहे हैं.
- इस समय पानी के कम मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण के लिए एकत्र हो सकता है. नमूना के 5 एमएल तरल नाइट्रोजन में तत्काल फ्लैश ठंड के साथ कोई लगानेवाला एजेंट के साथ cryovial जोड़ा जा सकता है.
4. वायरल उत्पादन माइक्रोस्कोपी (नोबल और Fuhrman 1998, वेन एट अल 2004.)
- जमे हुए 0.02-सुक्ष्ममापी माइक्रोस्कोपी के लिए फ़िल्टर्ड किया जा नमूनों पर बर्फ thawed किया जाना चाहिए.
- बाँझ पानी के साथ शेयर समाधान 1:10 गिराए द्वारा SYBR ग्रीन के एक शेयर समाधान तैयार करें. अगला, शेयर समाधान से, बाँझ पानी के 39 एमएल शेयर समाधान के 1ml जोड़कर एक काम समाधान तैयार है. एक 50% ग्लिसरॉल, 50% फॉस्फेट खारा समाधान buffered (Pbs, 0.05 एम ना 2 4 HPO, 0.85% NaCl, पीएच 7.5) और ताजा 2.5% पी phenylenediamine के शेयर समाधान भी शुरुआत से पहले तैयार किया जाना चाहिए. 4 में 50% glycerol/50% पीबीएस समाधान रखें डिग्री सेल्सियस और पी phenylenediamine शेयर ° -20 पर शुरू जब तक अंधेरे में सी. राइट फ़िल्टरिंग पहले से 50% glycerol/50% पीबीएस तक 0.1% की एक अंतिम एकाग्रता Antifade समाधान के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए पी phenylenediamine जोड़ने.
- 25 .02 एक MicronStep 0.45-सुक्ष्ममापी, cellulosic समर्थन फिल्टर के शीर्ष पर सुक्ष्ममापी Anodisc फिल्टर मिमी रखें. Anodisc और 20 pKa में वैक्यूम के शीर्ष करने के लिए तय नमूने के 850 μL जोड़ें जब तक पूरी तरह से सूखे. प्लेस SYBR ग्रीन काम कर रहे एक बाँझ पेट्री डिश के लिए समाधान की 100 और μL, पर अभी भी वैक्यूम के साथ, ध्यान से फिल्टर और SYBR ग्रीन पर टॉवर जगह से Anodisc हटायें. अंधेरे में नमूने 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. ध्यान SYBR ग्रीन समाधान से फिल्टर को हटाने और के लिए सभी अवशिष्ट डाई हटाने के लिए एक Kimwipe साथ फिल्टर के पीछे बाती. अगर वांछित, टॉवर फिल्टर लौटने और 0.02 सुक्ष्ममापी फ़िल्टर्ड पानी या बाँझ मीडिया के 800 μL के लिए रवाना अतिरिक्त दाग कुल्ला फिल्टर के माध्यम से पारित.
- एक खुर्दबीन स्लाइड antifade समाधान की एक छोटी सी बूंद जोड़ें और शीर्ष पर एक कवर पर्ची जगह. कवर पर्ची निकालें और antifade समाधान के साथ गीला खुर्दबीन स्लाइड के लिए सूखे फिल्टर जोड़ने. फिर से, कवर पर्ची antifade समाधान की एक छोटी राशि जोड़ सकते हैं और धीरे धीरे यह फिल्टर के शीर्ष पर जगह है, किसी भी बुलबुले कि फार्म का हो सकता है से छुटकारा पाने के लिए सुनिश्चित बनाने.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत स्लाइड्स फ्रीज जरूरत जब तक (इन कुछ महीनों के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए करने के लिए लुप्त होती रोकने के और वायरस मायने रखता है कम)
- वायरस एक विस्तृत नीले फ़िल्टर सेट (λ एक्स = 450 करने के लिए 490 एनएम, λ एम = λ पर एक दमन फिल्टर के साथ 510 एनएम = 510 एनएम) के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (हमारे मामले में एक Leica DMRXA माइक्रोस्कोप) का उपयोग enumerated हैं. प्रत्येक फिल्टर गिना दृश्य के कम से कम 20 क्षेत्रों, प्रत्येक क्षेत्र ग्रिड से कुल वायरस यों फिल्टर झिल्ली भर भी वायरस के वितरण को सुनिश्चित करने के सुनिश्चित करने के.
- तीन स्वतंत्र से वायरस reoccurrence की औसतन दर replicates रहे हैं तो गणना और एक मानक विचलन उत्पादन की दर से निर्धारित किया जाता है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
कच्चे अनुसंधानकर्ता द्वारा एकत्र आंकड़ों का न्यूनतम गणितीय प्रसंस्करण के लिए वायरस बहुतायत के reoccurrence दरों उत्पन्न की आवश्यकता है. प्राथमिक डेटा इस अध्ययन से उत्पन्न सेट incubations से subsamples में वायरस बहुतायत के reoccurrence दरों है. इन परिणामों के नमूने के प्रत्येक के लिए वायरस बहुतायत बनाम समय की स्वतंत्र regressions के रूप में. प्रत्येक नमूने के लिए व्यक्तिगत incubations एक इलाज के रूप में कार्य है, तो तीन को दोहराने के incubations पूरा शोधकर्ता के रूप में अच्छी तरह के रूप में भिन्नता के एक अनुमान (उदाहरण के लिए, मानक विचलन) (चित्रा 1 देखें.) की दर की गणना कर सकते हैं
इस प्रक्रिया का एक चेतावनी है कि वायरस बहुतायत अचल में कमी नमूना है कि वायरस बोझ ले जा रहे हैं में मेजबान कोशिकाओं में कमी की ओर जाता है है. यह दोनों स्रोत (अनफ़िल्टर्ड समुद्री जल या झील पानी) और टी = 0 ऊष्मायन नमूना से बैक्टीरियल बहुतायत के गणन नुकसान ऑफसेट करने के लिए आवश्यक हैं. यह जानकारी खो कोशिकाओं के प्रतिशत के लिए खाते में इस्तेमाल किया जा सकता है: यह सोचते हैं कि वायरस बहुतायत को कम करने की प्रक्रिया के लिए या माइक्रोबियल समुदाय के किसी सदस्य के खिलाफ चयनात्मक नहीं है, इस पहलू तो वायरस के स्वस्थानी उत्पादन दर में अनुमान किया जा सकता है .
चित्रा 1. epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए सीटू परिस्थितियों में एक 10 घंटे की ऊष्मायन में कणों की तरह वायरस के नमूने के उत्पादन phytoplankton के दौरान एकत्र किए गए बंद के सितंबर 2008 में न्यूजीलैंड के तट खिल.
चित्रा 2. वायरस उत्पादन परख करने की क्रिया के लिए काम प्रवाह की प्रक्रिया के योजनाबद्ध आरेख. प्रक्रिया नमूना पानी की ultrafiltration वायरस मुक्त पानी उत्पन्न करने के साथ शुरू होता है. यह एक ultrafiltration प्रणाली का उपयोग कर पूरा हो गया है. समानांतर पानी के नमूने में एक ही साइट और मुक्त वायरस एक फिल्टर के माध्यम से पारित से एकत्र कर रहे हैं जबकि माइक्रोबियल समुदाय (संक्रमित और गैर - संक्रमित कोशिकाओं के एक मिश्रण युक्त) को बनाए रखा है. इस समुदाय तो वायरस मुक्त पानी में resuspended है और सीटू शर्तों में के तहत incubated. वायरस के reoccurrence दर तो अगले 10 घंटे के लिए निगरानी की है वायरस उत्पादन की दर का निर्धारण.
Discussion
समझने में एक महत्वपूर्ण घटक है कैसे वायरस समुद्री माइक्रोबियल समुदायों को प्रभावित करने के लिए दर है जिस पर वायरस कण का उत्पादन कर रहे हैं निर्धारित है. देखते हुए कि abundances सबसे प्रणालियों में (कम या ज्यादा) स्थैतिक (विल्हेम और Suttle 1999, 2004 Weinbauer), और है कि वायरस को हटा रहे हैं या गैर संक्रामक गाया जलीय प्रणालियों में जल्दी (1998 विल्हेम एट अल.) है, तो उत्पादन दर होना चाहिए रिश्तेदार तेजी से खो कणों को प्रतिस्थापित करने के लिए.
आकलन मृत्यु दर वायरस माइक्रोबियल समुदाय के कारण कई कैसे वायरस हर बार जब एक वायरस एक सेल ("फट आकार") lyses उत्पादित कर रहे हैं के ज्ञान की आवश्यकता है. वायरस प्राकृतिक नमूनों में फट आकार बहुत भिन्न हो सकते हैं. फट आकार संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (जैसे Weinbauer, और Peduzzi 1994) के द्वारा सीधे निर्धारित कर सकते हैं, लेकिन यह अक्सर एक भी प्रयोगशाला की क्षमताओं से परे है या व्यावहारिक नहीं हमेशा. स्थितियों जहाँ वे empirically निर्धारित नहीं किया जा सकता है, lytic घटना प्रति 24 वायरस के साहित्य मूल्यों समुद्री सिस्टम मीठे पानी के लिए प्रणाली और 34 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (Parada एट अल 2006). यदि वायरस उत्पादन की दर इस संख्या से विभाजित है, तो परिणाम एक दैनिक आधार पर वायरस के द्वारा नष्ट की मात्रा प्रति कोशिकाओं की बहुतायत है. मूल्य रोगाणुओं lysed तो बैक्टीरियल बहुतायत के प्रश्न में सिस्टम के लिए वायरस प्रेरित मृत्यु दर में जिसके परिणामस्वरूप खड़े स्टॉक द्वारा विभाजित किया जा सकता है: मौजूदा अनुमान रेंज कुछ प्रतिशत से लगभग पूरी आबादी के लिए कर रहे हैं और अक्सर प्रश्न में सिस्टम में अन्य कारकों पर निर्भर (विल्हेम और Matteson 2008). कुल मृत्यु दर का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए इस संख्या अक्सर दो (धारणा से काम कर रहा है कि कोशिकाओं के 50% पर जाने के लिए पुन: पेश करने और कोशिकाओं के 50% खो दिया है, Weinbauer 2004) से गुणा है.
देखते हुए कि पोषक तत्व और ट्रेस तत्व bioavailability (उदाहरण के लिए, एन, पी, Fe) प्राथमिक उत्पादकता की दर की सीमा है, और कर सकते हैं, जैसे कार्बन प्रवाह के रूप में जलीय प्रणालियों के माध्यम से, और इस प्रक्रिया में संचालित वायरस माइक्रोबियल मृत्यु दर की भूमिका की समझ बन गया है समुद्री geochemists के लिए ब्याज की. अब कई अनुमानों मौजूद सुझाव है कि वायरस पोषक तत्व तत्वों की एक महत्वपूर्ण सांद्रता वापस एक दैनिक आधार पर पानी स्तंभ रिहाई (Rowe एट अल 2008, हिगिंस एट अल. 2009) और माइक्रोबियल समुदाय द्वारा इन तत्वों को तेजी से आत्मसात कर रहे हैं कि (Poorvin एट अल 2004 Mioni, एट अल. 2005). पोषक तत्व प्रवाह की दर पर्यावरण के लिए पोषक तत्वों के प्रति सेल (चिह्नित "कोटा") की राशि से नष्ट कोशिकाओं की संख्या को गुणा करके निर्धारित किया जा सकता है. यह जानकारी कैसे माइक्रोबियल खाद्य जाले जलीय प्रणालियों में समारोह के बारे में हमारी समझ के लिए एक महत्वपूर्ण घटक प्रदान कर सकते हैं.
चल रहे घटनाक्रम: अनुसंधान समूहों की एक श्रृंखला द्वारा वर्तमान प्रयासों ऊपर करने के लिए समुदाय के भीतर विशिष्ट वायरस एन्यूमरेट रणनीति आदत डाल शामिल है और, जैसे, निर्धारित करने के लिए कैसे विशिष्ट जीवों वायरस गतिविधि से प्रभावित हैं. ऐसा करने के लिए शोधकर्ताओं ने मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन (qPCR) प्रतिक्रिया करने के लिए समानांतर में कुल वायरस समुदाय के अनुमानों के लिए विशिष्ट वायरस समूह या परिवारों की बहुतायत का अनुमान का उपयोग करें. परिणाम तो सीधे वायरस मृत्यु दर, पोषक तत्व कारोबार विशिष्ट प्लवक समूहों के लिए, आदि का अनुमान प्रदान करने के लिए लागू होता है. इस शक्तिशाली नए दृष्टिकोण आने वाले वर्षों में शोधकर्ताओं ने अधिक गहरा वायरस की पारिस्थितिकी के साथ जुड़े प्रक्रियाओं में खुदाई करने के लिए और, पहली बार के लिए, प्रयोगशाला प्रणाली की बाधाओं से परे विशिष्ट वायरस मेजबान समुदायों की बातचीत यों की अनुमति देगा.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस लेख के प्रकाशन के टेनेसी विश्वविद्यालय में अनुसंधान के कार्यालय से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. लेखकों छात्रों और शोधकर्ताओं है कि इन प्रक्रियाओं को निखारने के लिए काम किया है की पिछली पीढ़ी धन्यवाद. अनुसंधान के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF-0,851,113, NSF 0,825,405 और NSF 0,550,485) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% p-phenylenediamine | Acros Organics | 130575000 | Stock for Antifade |
| Amicon Proflux M12 system | EMD Millipore | N/A | Any ultrafiltration device may be used for this step |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Invitrogen | S-7563 | |
| Helicon S10 30kDa Filter | EMD Millipore | CDUF010LT | |
| Pelicon XL filters 0.22 μm | Fisher Scientific | PXGVPPC50 | |
| GE 0.2 μm PCTE membrane filters (47mm) | Fisher Scientific | 09-732-35 | |
| Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System | EMD Millipore | XX42LSS11 | Other TFF systems may be used for this step |
| 0.45 μm Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm) | Fisher Scientific | E04WP02500 | |
| GE Whatman 0.02 μm Anodisc filters (25mm) | Fisher Scientific | 68-09-6002 | |
| Leica DMRXA microscope | Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used | ||
| 20L polycarbonate carboys | Fisher Scientific | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5) | Fisher Scientific | BP329-500, S640-500 | |
| 50% Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G151-1 | |
| Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-71 | Any cryovials may be used |
| Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-74 | Any cryovials may be used |
| 85% H3PO4 | Fisher Scientific | A242-212 | Spiral Membrane storage |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-3 | M12 cleaning |
| Graduated Cylinders | |||
| Isopore 0.8-μm pore-size membrane filter (142mm) | EMD Millipore | ATTP14250 | |
| Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm) | Fisher Scientific | YY30 090 00 |
References
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