Summary
海洋および淡水系におけるウイルスの離職率は低下し、再発の手法によって推定することができる。データは、研究者は、水系におけるウイルス媒介微生物の死亡率を推測することができます。
Abstract
ウイルスは、海洋および淡水システムの広範な成分であり、微生物の死亡率の重要な薬剤であることが知られている。我々はその後、微生物群集の構造と機能の優れたモデルを開発するだけでなく、ウイルスが水生生物地球化学サイクルを変更する仕組みについての我々の理解を進めることができるように、このプロセスの定量的な推定を開発することが重要です。ウイルスの低減技術は、研究者は、ウイルス粒子が風土病微生物群集から放出される速度を見積もることができます。微生物群集が付近の周囲の濃度に維持しながら簡単に言えば、フリー（細胞外）ウイルスの存在量は、サンプルに低減されます。微生物群集は、その後、フリーのウイルスや落射蛍光顕微鏡または、特定のウイルスの場合で、定量的で定量化することができるウイルスサンプルの再発（コミュニティのすでに感染しているメンバーの溶解を通じて）レートの存在下でインキュベートするPCR。これらのレートは、その後、ウイルス媒介細胞溶解に起因する微生物の死亡率を推定するために使用することができます。
Protocol
1。 "ウイルスフリー"水（ヴィルヘルム＆Poorvin 2001）を生成するために海水の限外ろ過
- 海水/ lakewaterの約20Lを無菌的に可能な限り収集されます。
- 水はシリアル142 - mm径のポリカーボネートを通じて地域社会の分析のために-20℃で保管することができます0.8μmのフィルタをフィルタ処理されている。より大きな孔径のフィルターは、非常に生産的なシステムのためのこのステップの前に使用することができます。
- 30kDaのカットオフスパイラルカートリッジはすべてのウイルスを排除するために使用されるアミコンM12システム（ミリポア）、さらに小型のRNAウイルスから限外濾過水を得るために。
- サンプルは、背圧の〜15から16 kPaで〜25％の速度で処理し、濃縮されています。
- 水の〜500mLの残りのサンプルでは、ウイルスのない水の残りの19.5 Lのウイルス産生のアッセイに使用される一方、濃縮ウイルスのコミュニティを（これは他の実験のために保存することができる）が含まれます。
- 使用のそれぞれの一日を過ごした後、アミコンM12システムは、フィルターカートリッジの膜への損傷を防ぐために洗浄する必要があります。
- もし海水を使用している場合は、30〜45分のための0.1N NaOH溶液で洗浄した後、Milli - Q水の少なくとも6Lで膜をすすいでください。
- 再びMilli - Q水の少なくとも6Lでカートリッジをすすいでください。
- M12システムの使用を終了するときに、スパイラルのカートリッジは4で0.05MH 3 PO 4水溶液℃で保存してください。
2。ウイルス産生のためのウイルスの削減手法（ヴィルヘルムら、2002）
- その上に置かれた0.2μmの公称孔径の低タンパク質結合フィルター（例えば、デュラポア）で取得し、sterifilterユニットに配置され、最大ホストとウイルスの両方で海水/ lakewaterサンプルの500mlに。
- 継続的にフィルターに集中するから、細菌細胞を抑制するために無菌トランスファーピペットを使用してサンプルを再懸濁しながら、サンプルを穏やかに<200 mmHgの時に圧力をかけて真空されています。
- ゆっくりと限外濾過の三巻が大幅に試料中の遊離ウイルスの数を減らすために細菌懸濁液に添加されています。
- 細菌の割合は、ウイルスフリーの水で500mLに戻って希釈し、3つに分割されている150mLのそれぞれの複製と透明な250ミリリットルポリカーボネートボトルに配置されます。
3。ウイルス産生のためのタンジェンシャルフローフィルトレーション（TFF）メソッド（Weinbauer ら、2002、ウィンゲットら、2005）
TFFは、ウイルス還元法に代わるアプローチを表します。
- 上記のような天然試料の約500mLを集めています。
- このサンプルは、0.2μmの公称孔径タンジェンシャルフローろ過システムを用いて濃縮される。
- 細菌の割合が約10〜15 mLに低下すると、限外濾過、ウイルスフリー水を添加し、上記のように配布されています。
- 複製ボトルは、環境槽を用いてその場の条件でインキュベートする。
- 光レベルは、光強度を減少させるためにネットスクリーニングと青がかったアクリルまたは透明なアクリルを使用して表面状態に変更されます。
- 周囲の表面温度は、しばしば流れる海水デッキインキュベーターを使用することによって得られる。
- 細菌とウイルスの資源量推定値のサンプルはcryovialsに追加さ2.0〜2.5パーセント滅菌グルタルアルデヒドの最終濃度で、時間0で撮影されています。これらのサンプルは、直ちに液体窒素で凍結させ、処理されるまで凍結されたフラッシュされています。
- 液体窒素が使用できない場合は、顕微鏡のスライドは、（次の手順を参照）を調製し、直ちに処理されることがあります。
- サブサンプルは、上記の方法で少なくとも10時間毎に2.5時間を集めています。
- この時点で水は定量的PCR解析のために収集されることがあります。最大サンプルを5 mLまで液体窒素中で即座にフラッシュの凍結と無固定剤をクライオバイアルに添加することができる。
4。ウイルスの生産顕微鏡（ノーブル＆ファーマン1998年、温家宝ら 2004）
- 0.02μmの顕微鏡用にフィルタリングされる凍結試料を氷上で融解してください。
- 滅菌水で原液を1:10に希釈してSYBR Greenのストック溶液を調製。次に、ストック溶液から、滅菌水39 mLに原液の1mlを加えることによって、作業溶液を調製。 50％グリセロール、50％のリン酸塩は生理食塩水をバッファ（PBS、0.05 MのNa 2 HPO 4、0.85％のNaCl、pH7.5）およびp -フェニレンジアミンの新鮮な2.5％の原液は、開始前に準備する必要があります。 4に50％glycerol/50％PBS溶液を保持° CとP - phenylenediam-20伊根の株式△初任まで、暗所で。右の退色防止ソリューションとして使用される最終濃度0.1％を50％glycerol/50％PBSにp -フェニレンジアミンを追加フィルタリングの前に。
- 0.45μmのMicronStep、セルロース系バッキングフィルターの上に0.02μmのAnodiscフィルター25mmを置きます。完全に乾くまでに20のpKaでAnodiscと真空の上部に固定されたサンプル850μLを加える。場所100滅菌シャーレにSYBRグリーンワーキング溶液μLと、上でも、真空で、慎重にSYBRグリーン上でフィルタ塔と場所からAnodiscを削除します。 20分間室温で暗所でサンプルをインキュベートする。慎重にSYBR Green液からフィルタを削除して、すべての残留色素を除去するキムワイプとフィルターの後ろを放出する。必要に応じて、タワーにフィルターを戻し、余分な汚れを洗い流しますするフィルタを介して0.02μmのフィルタ処理された水または無菌のメディアの800μLまで渡す。
- 顕微鏡のスライドに退色防止ソリューションの小滴を追加し、上にカバースリップを配置。カバーガラスを外し、退色防止ソリューションによる湿式顕微鏡のスライドに乾燥フィルタを追加します。再び、カバーガラスに退色少量の溶液を加えると徐々に形成する可能性のある気泡を取り除くために確認しながら、フィルターの上に置きます。
- 必要になるまで、すぐに（これらはフェージングと低下ウイルスのカウントを防ぐために、数ヶ月以内に使用されるべきである）-20℃でスライドを凍結する
- ウイルスは、広い青いフィルターセット（λ 例 = 450〜490 nmの、λ エム λにおける抑制フィルタ付き= 510 nmの= 510 nm）を（我々の場合ライカDMRXA顕微鏡）蛍光顕微鏡を使用して列挙されます。各フィルタは、フィルタ膜を通過するウイルスを均等に各フィールドのグリッドから合計ウイルスを定量化することを確認し、カウントビューの少なくとも20個のフィールドを持つことになります。
- 三つの独立からのウイルスの再発の平均速度は、計算されると標準偏差は、生産率から決定される複製。
5。代表的な結果
研究者によって収集された生データは、ウイルスの存在量の再発率を生成するための最小限の数学的処理が必要になります。この研究から生じる主要なデータセットには、インキュベーションから二次検体中のウイルスの存在量の再発率である。これらの結果は、試料の各々のウイルスの存在量対時間の独立した回帰を形成する。各サンプルについて、個々のインキュベーションでは、その研究者が同様に変動の推定値（例えば、標準偏差）として速度を計算することができる3つの繰り返し、インキュベーションを行うことにより、一つの治療、（図1を参照。）として機能
このプロセスの一つの注意点は、ウイルスの存在量不変の減少は、ウイルスの負担を運んでいるサンプルで宿主細胞の減少につながるということです。この損失を相殺するために、ソース（フィルタ処理されていない海水や湖沼の水）とT = 0インキュベーションのサンプルの両方からの細菌の存在量の列挙が必要です。この情報は、失われた細胞の割合を考慮するために使用することができます。ウイルスの存在量を減少させるプロセスは微生物コミュニティのあらゆるメンバーのためにまたはに対して選択的ではない、この因子がその後、ウイルスのその場の生産率の推定に使用することができると仮定。
図1。落射蛍光顕微鏡を用いた原位置条件下で少なくとも10時間のインキュベーションオーバーウイルス様粒子の生産。サンプルは2008年9月にニュージーランド沖の咲く植物プランクトン中に収集された。
図2。ウイルス産生をアッセイするためのワークフロープロセスの模式図。プロセスは、ウイルスフリー水を生成するために、サンプル水のろ過から始まります。これは、限外ろ過システムを使用して完了します。微生物群集が（感染および非感染細胞の混合物を含有する）保たれる間、パラレル水サンプルに同じサイトから収集され、無料のウイルスがフィルターを通過。このコミュニティは、ウイルスフリーの水に再懸濁し、 その場の状況の下でインキュベートする。ウイルスの再発率は、ウイルス産生の速度を決定するために、次の10時間監視されています。
Discussion
ウイルスは、海洋微生物群集にどのように影響するかを理解する上で重要な部品とは、ウイルス粒子が生成されるレートを決定することです。 （ヴィルヘルムら、1998）水生システムに迅速に存在量はほとんどのシステムでは（多かれ少なかれ）静的であることを考えると（ヴィルヘルム＆サトル1999、Weinbauer 2004）、そしてそのウイルスは、非感染性の除去またはレンダリングされ、その後、生産率は、でなければならない相対的な急速な失われた粒子を交換する。
死亡率のウイルスは微生物群集の原因と推定することは、ウイルスが細胞を（"バーストサイズ"）溶解するたびに、生成される多くのウイルスの知識が必要です。天然試料中のウイルスのバーストサイズは大きく異なる可能性があります。バーストサイズは、透過型電子顕微鏡（例えば、Weinbauer＆Peduzzi 1994）によって直接決定されるが、これは必ずしも現実的ではない与えられた実験室の能力を超えて多くの場合、またはすることができます。それらは経験的に決定することができない状況では、溶解イベントあたり24ウイルスの文献値は、海洋システムや淡水系（パラダほか 2006）のための34のために使用することができます。ウイルス産生の割合がこの数値によって分割されている場合、結果は毎日、ウイルスによって破壊された体積あたりの細胞の豊富さです。値を溶解微生物は、問題のシステムのためのウイルスによる死亡率をもたらす細菌の存在量の立っている株式によって分けることができます。数パーセントからほぼ全人口に既存の推計範囲及び当該のシステムではしばしば他の要因に依存しています（ヴィルヘルム＆マッテソン2008）。総死亡率の割合を決定するためにこの数は、多くの場合、両者（細胞の50％が再現するに行くことを前提で仕事をし、細胞の50％が失われ、Weinbauer 2004）によって乗算されます。
となっている栄養素や微量元素の生物学的利用能（例えば、N、P、Fe）の一次生産の速度を制限し、そのような炭素フラックスとして、水生システムを通じて、そしてこの過程でウイルス駆動型微生物の死亡率の役割を理解できることを考える海洋地球化学への関心の。いくつかの推定値は、現在（2009年、2008年、ヒギンズらロウら ）ウイルスが日常的に水の列に戻って養分の有意な濃度を放出示唆それが存在し、これらの要素が急速に微生物群集によって同化されること（Poorvin らら2004年、ミら、2005）。環境への養分フラックスの割合は、栄養素ごとのセル（"クォータ"と表記）の量によって破壊された細胞の数を乗じて求めることができます。この情報は、微生物食物網は、水系全体でどのように機能するかについての我々の理解に不可欠なコンポーネントを提供することができます。
継続的な開発：現在の努力の研究グループの一連では、コミュニティ内の特定のウイルスを列挙すると、次のような、ウイルスの活動によって影響を受けているどのように特定の微生物を決定するために上記の戦略を適応させる伴う。これを行うには、研究者は全体のウイルスのコミュニティの推定値に並行して特定のウイルスのグループや家族の存在量を推定する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（定量PCR）を使用してください。結果は、直接、特定のプランクトンのグループのためのウイルスの死亡率、栄養売上高などの推定値を提供するために適用されます。この強力な新しいアプローチは、今後数年間で研究者が実験室のシステムの制約を超えて特定のウイルス - 宿主の社会の相互作用を定量化するためにウイルスの生態学に関連するプロセスや、初めて、にはるかに深く掘ることができます。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この記事の出版物は、テネシー大学の研究局からの助成金によって支えられて。著者らは、これらの手順を絞り込むには働いている学生や研究者の前世代に感謝。研究は全米科学財団（NSF - 0851113、NSF - 0825405とNSF - 0550485）からの補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% p-phenylenediamine | Acros Organics | 130575000 | Stock for Antifade |
| Amicon Proflux M12 system | EMD Millipore | N/A | Any ultrafiltration device may be used for this step |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Invitrogen | S-7563 | |
| Helicon S10 30kDa Filter | EMD Millipore | CDUF010LT | |
| Pelicon XL filters 0.22 μm | Fisher Scientific | PXGVPPC50 | |
| GE 0.2 μm PCTE membrane filters (47mm) | Fisher Scientific | 09-732-35 | |
| Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System | EMD Millipore | XX42LSS11 | Other TFF systems may be used for this step |
| 0.45 μm Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm) | Fisher Scientific | E04WP02500 | |
| GE Whatman 0.02 μm Anodisc filters (25mm) | Fisher Scientific | 68-09-6002 | |
| Leica DMRXA microscope | Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used | ||
| 20L polycarbonate carboys | Fisher Scientific | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5) | Fisher Scientific | BP329-500, S640-500 | |
| 50% Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G151-1 | |
| Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-71 | Any cryovials may be used |
| Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-74 | Any cryovials may be used |
| 85% H3PO4 | Fisher Scientific | A242-212 | Spiral Membrane storage |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-3 | M12 cleaning |
| Graduated Cylinders | |||
| Isopore 0.8-μm pore-size membrane filter (142mm) | EMD Millipore | ATTP14250 | |
| Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm) | Fisher Scientific | YY30 090 00 |
References
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