Summary
A taxa de rotatividade de vírus em sistemas marinhos e de água doce pode ser estimado por uma redução e técnica recorrência. Os dados permitem aos pesquisadores inferir as taxas de mortalidade do vírus mediada microbiana em sistemas aquáticos.
Abstract
Os vírus são componentes generalizada dos sistemas marinhos e de água doce e são conhecidos por serem agentes significativa da mortalidade microbiana. Desenvolver estimativas quantitativas deste processo é fundamental como podemos então desenvolver melhores modelos de estrutura da comunidade microbiana e função, bem como o avanço na compreensão do funcionamento dos vírus para alterar aquáticos ciclos biogeoquímicos. A técnica de redução de vírus permite que os pesquisadores para estimar a taxa em que partículas de vírus são liberados da comunidade microbiana endêmica. Em breve, a abundância de livre (extracelular) Os vírus é reduzida em uma amostra enquanto a comunidade microbiana é mantida a concentração ambiente próximo. A comunidade microbiana é, então, incubadas na ausência de vírus livres ea taxa em que os vírus reaparecer na amostra (através da lise de membros já infectados da comunidade) podem ser quantificados por microscopia de epifluorescência, ou, no caso de vírus específicos, quantitativos PCR. Essas taxas podem ser usados para estimar a taxa de mortalidade microbiana devido ao vírus mediada por lise celular.
Protocol
1. Ultrafiltração da água do mar para gerar "Virus-free" de água (Wilhelm & Poorvin 2001)
- Cerca de 20L de água do mar / lakewater é coletado como assepticamente possível.
- A água é serialmente através prefiltered 142 mm de diâmetro em policarbonato 0,8 mM filtros que podem ser mantidos a -20 ° C para análise da comunidade. Filtros de maior tamanho dos poros pode ser usado antes de este passo para sistemas muito produtivos.
- Para obter água de um ultrafiltrado M12 Amicon sistema (Millipore) de 30 kDa cartucho espiral de corte é usada para excluir todos os vírus, mesmo pequenos vírus RNA.
- As amostras são processadas e concentradas em ~ 25% a velocidade com ~ 15-16 kPa de contrapressão.
- A amostra restante de aproximadamente 500 mL de água irá conter uma comunidade vírus concentrado (que pode ser guardado para outras experiências), enquanto os restantes 19,5 L de água livre de vírus será utilizado para ensaios de produção viral.
- Após cada dia de uso, o M12 Amicon sistema devem ser limpos para evitar danos à membrana do filtro.
- Se você estiver trabalhando com água do mar, lavar a membrana com, pelo menos, 6L de água Milli-Q seguida por uma lavagem com solução de NaOH 0,1 N por 30-45 minutos.
- Lavar novamente o cartucho com, pelo menos, 6L de água Milli-Q.
- Quando terminar de usar o sistema M12, o cartucho espiral deve ser armazenado em um 3 PO 4 0.05MH solução a 4 ° C.
2. Método de Redução do vírus para produção Viral (Wilhelm et al. 2002)
- Até 500 mL da amostra da água do mar / lakewater com o anfitrião e os vírus são obtidas e colocadas em uma unidade sterifilter com 0,2 mícrons nominal dos poros do tamanho de baixa ligação às proteínas do filtro (por exemplo, Durapore) colocados sobre ele.
- A amostra é suavemente pressionado a vácuo em <200 mmHg, enquanto continuamente ressuspender a amostra com uma pipeta de transferência estéril para inibir as células bacterianas de se concentrar no filtro.
- Lentamente, três volumes de ultrafiltrado são adicionados à suspensão bacteriana para reduzir significativamente o número de vírus livre na amostra.
- A fracção bacteriana é diluído de volta para 500 mL com água livre de vírus e dividido em três repetições de 150 mL cada e são colocados em garrafas de 250ml claro policarbonato.
3. Filtração tangencial Fluxo Método (TFF) para a Produção Viral (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005)
TFF representa uma abordagem alternativa para o método de redução viral.
- Aproximadamente 500 mL de amostra natural é coletado como descrito acima.
- Esta amostra é concentrada através de um 0,2 mícrons nominal dos poros do tamanho de sistema de filtração de fluxo tangencial.
- Quando a fração de bactérias é reduzida a cerca de 10-15 mL, ultrafiltrado, a água livre de vírus é adicionada e distribuída como acima.
- As garrafas são incubadas a replicar em condições in situ, usando câmaras ambientais.
- Níveis de luz são alteradas para as condições da superfície, usando de cor azul de acrílico transparente com acrílico ou screening net para diminuir a intensidade da luz.
- Temperaturas da superfície do ambiente são muitas vezes obtidos através de um fluxo de água do mar baralho incubadora.
- Amostras para estimativas de abundância bacteriana e viral são tomadas no tempo 0, com uma concentração final de 2,0-2,5% glutaraldeído estéril adicionado em criotubos. Estas amostras são imediatamente flash congelado com nitrogênio líquido e armazenadas congeladas até ser transformado.
- Se nitrogênio líquido não estiver disponível, lâminas de microscopia podem ser preparados e transformados imediatamente (ver procedimento abaixo)
- Subamostras são coletadas a cada 2,5 horas para pelo menos 10 horas pelo método descrito acima.
- Neste momento a água pode ser recolhida para análise de PCR quantitativo. Até 5 mL da amostra pode ser adicionado a uma cryovial com nenhum agente fixador com congelamento de flash imediata em nitrogênio líquido.
4. Microscopia de Produção viral (Noble & Fuhrman 1998, Wen et al. 2004)
- Amostras congeladas a ser 0,02 mM filtrada para microscopia devem ser descongeladas no gelo.
- Prepare uma solução estoque de SYBR Green diluindo a 1:10 solução estoque com água estéril. Em seguida, a partir da solução estoque, preparar uma solução de trabalho, adicionando 1 ml da solução estoque para 39 mL de água estéril. A glicerol a 50%, 50% de fosfato tamponado soluções salinas (PBS, 0,05 M Na 2 HPO 4, 0,85% NaCl, pH 7,5) e solução estoque fresco de 2,5% de p-fenilenodiamina também deve estar preparado antes de começar. Manter os 50% glycerol/50% de solução PBS a 4 ° C e os p-phenylenediamine estoque a -20 ° C no escuro até de partida. Direito antes de adicionar a filtragem p-fenilenodiamina ao PBS 50% glycerol/50% para uma concentração final de 0,1% para ser utilizado como a solução Antifade.
- Coloque um de 25 mm 0,02 mícrons filtro Anodisc em cima de um MicronStep 0,45 mícrons, filtro backing celulósico. Adicionar 850 mL da amostra fixa para o topo da Anodisc e vácuo de 20 pKa até que esteja completamente seco. ML colocar 100 de SYBR solução Verde trabalhando para uma placa de Petri estéril e, com o vácuo ainda sobre, remova cuidadosamente a Anodisc a partir da torre do filtro e colocar on the Green SYBR. Incubar as amostras no escuro à temperatura ambiente por 20 minutos. Remova cuidadosamente o filtro da solução Verde SYBR e pavio parte de trás do filtro com um Kimwipe para remover todas as corante residual. Se desejar, o retorno do filtro para a torre e passar até 800 mL de 0,02 mícrons água filtrada ou meios estéreis através do filtro para enxaguar mancha excesso.
- Adicionar uma pequena gota de solução Antifade a uma lâmina de microscópio e coloque uma lamínula por cima. Remover a lamínula e adicionar o filtro seco para a lâmina de microscópio molhado com a solução Antifade. Mais uma vez, adicionar uma pequena quantidade de solução Antifade à lamínula e lentamente coloque-o em cima do filtro, certificando-se de se livrar de todas as bolhas que podem se formar.
- Congelar imediatamente os slides a -20 ° C até ser necessário (estes devem ser usados dentro de alguns meses para evitar desbotamento e reduziu a contagem de vírus)
- Os vírus são enumerados usando microscopia de fluorescência (no nosso caso um microscópio Leica DMRXA) com um conjunto azul gama de filtros (λ Ex = 450-490 nm, λ Em = 510 nm com um filtro de supressão em λ = 510 nm). Cada filtro terá pelo menos 20 campos de vista contadas, certificando-se de quantificar vírus total de cada grade de campo para assegurar uma distribuição de vírus através da membrana do filtro.
- Taxas médias de recorrência do vírus da independente três repetições são então calculados e um desvio padrão é determinada a partir das taxas de produção.
5. Resultados representante
Os dados brutos colhidos pela pesquisadora requer processamento matemático mínimo para gerar taxas de recorrência da abundância de vírus. O conjunto de dados primários resultantes deste estudo é a taxa de recorrência da abundância de vírus no subamostras das incubações. Estes resultados do formulário regressões independentes de vírus tempo vs abundância para cada uma das amostras. Para cada amostra, o incubações individuais atuam como um tratamento, por isso, completar três replicate-incubações o pesquisador pode calcular as taxas, bem como uma estimativa de variação (por exemplo, o desvio padrão) (ver Figura 1).
Uma ressalva deste processo é que a redução na abundância invariável vírus leva a uma redução nas células hospedeiras na amostra que estão carregando o fardo de vírus. Para compensar esta perda, a enumeração de abundância de bactérias, tanto a fonte (a água do mar não filtrada ou água do lago) e T = amostra de incubação 0 são necessárias. Esta informação pode ser usada para explicar o percentual de células perdidas: supondo que o processo de redução da abundância de vírus não é seletiva a favor ou contra qualquer membro da comunidade microbiana, este fator pode então ser usada para estimar a taxa de produção em situ de vírus .
Figura 1. A produção de amostras de vírus como partículas ao longo de um 10 horas de incubação em condições in situ por microscopia de epifluorescência. Foram coletados durante um bloom de fitoplâncton na costa da Nova Zelândia em setembro de 2008.
Figura 2. Diagrama esquemático do processo de fluxo de trabalho para ensaio de produção de vírus. O processo começa com a ultrafiltração de água da amostra para gerar vírus sem água. Este é preenchido por um sistema de ultrafiltração. Em amostras de água paralelas são recolhidos a partir do mesmo local e os vírus livres passados por um filtro, enquanto a comunidade microbiana (contendo uma mistura de células infectadas e não infectadas) é mantida. Esta comunidade é então ressuspendido em água livre de vírus e incubadas sob condições in situ. A taxa de recorrência do vírus é então monitorada para os próximos 10 horas para determinar as taxas de produção de vírus.
Discussion
Um componente crítico na compreensão de como os vírus influência comunidades microbianas marinhos é determinar a taxa em que partículas de vírus são produzidos. Dado que a abundância são (mais ou menos) estática na maioria dos sistemas (Wilhelm & Suttle 1999, Weinbauer 2004), e que os vírus são removidos ou tornados não-infecciosa rapidamente em sistemas aquáticos (Wilhelm et al. 1998), então as taxas de produção deve ser relativa rápida para substituir partículas perdido.
Estimar o vírus causas de mortalidade para a comunidade microbiana requer um conhecimento de quantos vírus são produzidos cada vez que um vírus lise de uma célula (o "tamanho da rajada"). Tamanhos vírus estourou em amostras naturais pode variar muito. Tamanhos explosão pode ser determinada diretamente por microscopia eletrônica de transmissão (por exemplo, Weinbauer & Peduzzi, 1994), mas este é muitas vezes além das capacidades de um dado laboratório ou não sempre prático. Em situações onde eles não podem ser empiricamente determinadas, valores de literatura de 24 vírus por evento lítico pode ser usado para sistemas marinhos e 34 para sistemas de água doce (Parada et al. 2006). Se a taxa de produção de vírus é dividido por este número, o resultado é a abundância de células por volume destruída por vírus em uma base diária. Os micróbios lisadas valor pode ser dividido pelo estoque de pé de abundância de bactérias, resultando na mortalidade induzida por vírus para o sistema em questão: faixa estimativas existentes a partir de alguns por cento para quase toda a população e muitas vezes são dependentes de outros fatores no sistema em questão (Wilhelm & Matteson 2008). Para determinar a porcentagem de mortalidade total este número é muitas vezes multiplicada por dois (trabalhando a partir do pressuposto de que 50% das células passam a se reproduzir e 50% das células são perdidas, Weinbauer 2004).
Dado que a biodisponibilidade de nutrientes e elementos traço (por exemplo, N, P, Fe) pode limitar a taxa de produtividade primária e, como tal fluxo de carbono, através de sistemas aquáticos, e compreensão do papel do vírus-driven mortalidade microbiana nesse processo tornou-se de interesse para geoquímicos marinhos. Várias estimativas sugerem que existem agora os vírus lançar um concentrações significativas de elementos nutrientes de volta para a coluna de água diariamente (Rowe et al. 2008, Higgins et al. 2009) e que estes elementos são rapidamente assimilados pela comunidade microbiana (Poorvin et al. 2004, Mioni et al. 2005). A taxa de fluxo de nutrientes para o meio ambiente pode ser calculado multiplicando o número de células destruídas pela quantidade de nutrientes por célula (denotado "quotas"). Esta informação pode fornecer um componente crítico para a nossa compreensão de como teias alimentares microbianas em função de sistemas aquáticos.
Desenvolvimentos em curso: Os esforços atuais por uma série de grupos de pesquisa envolvem a adaptação da estratégia acima para enumerar vírus específicos dentro da comunidade e, como tal, para determinar como organismos específicos são influenciados pela atividade de vírus. Para fazer isso os pesquisadores utilizam a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para estimar a abundância de grupos específicos vírus ou famílias em paralelo com as estimativas da comunidade virus total. Os resultados são então aplicados diretamente para fornecer estimativas de mortalidade do vírus, de nutrientes, etc para grupos específicos de plâncton. Esta abordagem nova e poderosa permitirá que os pesquisadores nos próximos anos para cavar muito mais profundamente nos processos associados com a ecologia do vírus e, pela primeira vez, para quantificar as interações específicas do vírus-hospedeiro comunidades além das limitações dos sistemas de laboratório.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
A publicação deste artigo foi apoiado por uma bolsa do Instituto de Pesquisa da Universidade de Tennessee. Os autores agradecem a geração anterior de estudantes e investigadores que têm trabalhado para aperfeiçoar esses procedimentos. Pesquisa foi suportada por concessões do National Science Foundation (NSF-0851113, 0825405 e NSF-NSF-0550485).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% p-phenylenediamine | Acros Organics | 130575000 | Stock for Antifade |
| Amicon Proflux M12 system | EMD Millipore | N/A | Any ultrafiltration device may be used for this step |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Invitrogen | S-7563 | |
| Helicon S10 30kDa Filter | EMD Millipore | CDUF010LT | |
| Pelicon XL filters 0.22 μm | Fisher Scientific | PXGVPPC50 | |
| GE 0.2 μm PCTE membrane filters (47mm) | Fisher Scientific | 09-732-35 | |
| Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System | EMD Millipore | XX42LSS11 | Other TFF systems may be used for this step |
| 0.45 μm Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm) | Fisher Scientific | E04WP02500 | |
| GE Whatman 0.02 μm Anodisc filters (25mm) | Fisher Scientific | 68-09-6002 | |
| Leica DMRXA microscope | Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used | ||
| 20L polycarbonate carboys | Fisher Scientific | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5) | Fisher Scientific | BP329-500, S640-500 | |
| 50% Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G151-1 | |
| Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-71 | Any cryovials may be used |
| Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene | Fisher Scientific | 09-761-74 | Any cryovials may be used |
| 85% H3PO4 | Fisher Scientific | A242-212 | Spiral Membrane storage |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-3 | M12 cleaning |
| Graduated Cylinders | |||
| Isopore 0.8-μm pore-size membrane filter (142mm) | EMD Millipore | ATTP14250 | |
| Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm) | Fisher Scientific | YY30 090 00 |
References
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