Summary
我们已经开发出一种慢病毒载体，拥有，除了达反应的LTR，冯应答元件（RRE）报告基因的表达在HIV - 1达和冯依赖的方式，可以调节。向量允许通过活细胞GFP表达的复制艾滋病毒的特异性检测。
Abstract
大部分的艾滋病毒抗体反应表达载体的基础上艾滋病毒的推动者，长末端重复序列（LTR）的。 LTR的响应早期艾滋病毒的蛋白质，达，也反应细胞活化状态，并整合发生的地方染色活动。这可能会导致艾滋病毒高独立的活动，并已成为制约LTR的记者有用标志艾滋病毒1,2,3阳性细胞。在这里，我们构建了一个表达的慢病毒载体，具有，除了达LTR的响应，许多艾滋病毒的DNA序列，包括冯响应元素和艾滋病毒剪接位点4,5,6。纳入一种慢病毒记者病毒载体，允许艾滋病毒的复制非常具体的检测活细胞群。测定绿色荧光蛋白（GFP）的表达载体的活动。这个向量的应用，这里提供了一个新颖的现有方法的替代方法，如原位PCR或HIV抗原染色，以确定HIV阳性细胞。载体也可以为基础或临床试验，针对艾滋病毒抗体阳性的细胞表达的基因治疗。
Protocol
1。冯依赖的慢病毒颗粒的生产质粒转染
设置：依赖REV - GFP慢病毒载体，PNL - GFP - RRE - SA，描述以前4,5,6。要组装成病毒颗粒，质粒是contransfected到HEK293 T细胞的HIV - 1包装构造，pCMVΔ8.2（请Dider Trono博士提供），质粒携带的VSV - G糖蛋白（pHCMV - G） 。使用磷酸钙法转染进行了。
缓冲区的制备：10 ×哈佛商学院（HEPES缓冲液）溶解5克HEPES，8克氯化钠0.37克氯化钾，1克葡萄糖，0.103克的Na 2 HPO 4（无水）在100毫升H 2 O。分装the10 X哈佛商学院的缓冲区为1毫升分装和储存在-20 ° C在转的时间，转换成10 ×哈佛商学院2个哈佛商学院与H 2 O（1：5稀释），并调整pH值至7.05 - 7.12 。 （10毫升2 ×哈佛商学院，它通常需要大约50μL1M氢氧化钠）。通过传递通过0.22μm的微孔过滤器，过滤消毒2X哈佛商学院的缓冲区。 氯化钙缓冲液是由溶解在10 mM的HEPES 氯化钙2至终浓度为2M 。调节pH值至5.8，过滤消毒的缓冲区，并储存于4 ° C。
程序：
- 转染前一天，种子2 × 10 6 HEK293T细胞在100毫米的Petri盘，增长37细胞在10毫升的DMEM + 10％FBS的隔夜℃，5％的CO 2。
- 第二天，取出细胞培养上清和取代5 mL新鲜的DMEM + 10％FBS，连续4小时的细胞培养。
- 在一个5毫升的聚苯乙烯管，加480μL的2倍哈佛商学院的缓冲区。
- 在第二个5毫升的聚苯乙烯管，添加60μL的2M 氯化钙 2缓冲区，质粒DNA，并转染TE缓冲液（1毫米的Tris，25 mM的EDTA，pH值8.0），一个总体积为480μL 。对于每个基于Petri盘，质粒应在10微克的PNL - GFP - RRE - SA，pCMVΔR8.3，7.5微克和2.5毫克pHCMV - G比例增加。
- 加入质粒DNA - 氯化钙混合滴加到2 x哈佛商学院管，并在室温下孵育30分钟。的罚款，沉淀就会形成。
- 吸管滴加细胞的混合物中加入960微升。在37℃，5％的CO 2过夜孵育。
- 第二天，去除上清液，并添加10毫升新鲜的DMEM + 10％FBS，并不断孵育的细胞在37℃，5％的CO 2一夜之间。
- 在转染后48小时，收获的病毒去除上清，转移到50 mL无菌管。添加到每个培养皿菜新鲜10毫升新鲜的DMEM + 10％FBS，继续培养过夜。病毒上清保存在4 ° C。
- 继续在72小时后转染收获，收集上清。合并所有上清，离心上清在500 XG 15分钟以沉淀，去除细胞碎片。
- 上清通过0.22μm的微孔过滤器收集和筛选。该病毒是通过体积排阻柱进一步集中。
2。浓缩病毒颗粒，并确定病毒滴度
- 病毒颗粒集中由一个体积排阻柱（100000兆瓦切断，Centricoin）。病毒上清装入列，在4 ° C 15分钟，并在6000 XG离心。
- 浓缩病毒上清，收集，分装，并保存于-80 ° C。
- 由TNF -α治疗的HIV - 1阳性外套细胞株，J1.1 7感染病毒滴度测定。在2.5 × 10 5细胞每毫升（100毫升的总量），细胞培养在96孔板和100毫升为一个星期连续稀释VNL - GFP的RRE - SA的感染。估计粒子的滴度（TCID50）以下的里德和Muench 8方法计数GFP阳性井。
3。标记HIV - 1阳性细胞的慢病毒颗粒，VNL - GFP - RRE - SA
设置：一个人的CD4 T细胞系，CEM - SS的，是先用HIV - 1感染。在感染后48小时，细胞的慢病毒颗粒，VNL - GFP - RRE - SA superinfected。另外两天的二重感染，GFP阳性细胞流式细胞仪分析。作为对照，HIV - 1未受感染的CEM - SS的细胞是相同的感染VNL - GFP - RRE - SA。 HIV - 1感染的CEM - SS的细胞，只有产生了GFP阳性细胞，但不是HIV - 1的未受感染的CEM - SS的细胞。
程序：
- 感染前的两个小时，加入终浓度为4毫克/毫升的polybrane。计数细胞，并采取2 × 10 5每个感染的细胞。感染200毫微克的HIV - 1的NL4 - 3（P24）2小时细胞。
- 洗涤离心10分钟，重新悬浮细胞在300 XG细胞为2 × 10 5细胞/毫升，和文化在37 ° C 48小时。
- 计数细胞，并采取2 × 10 5％感染的细胞与VNL - GFP - RRE - SA。添加100毫升VNL - GFP - RRE - SA的培养，在37 ° C过夜。洗涤细胞，重悬成2 × 10 5细胞/ mL。
- 执行48小时后二重感染流式细胞仪分析。感染的细胞颗粒和成500毫升1％paraformaldehede室温孵育20分钟，悬浮，然后在FACScan分析仪分析（流式细胞迪肯森）。
4。代表性的成果
如果实验成功地进行，一个庞大的GFP人口将流式细胞仪检测出HIV - 1感染细胞CEM - SS的，在控制，而GFP阳性细胞不会被检测到HIV - 1的未受感染的CEM - SS细胞。
如果实验成功执行，冯依赖的慢病毒载体，VNL - GFP - RRE - SA，将允许在活细胞数量的艾滋病毒复制非常具体的检测，测量通过绿色荧光蛋白（GFP）的表达。在这个例子中，收获CEM - SS的细胞染色的PE标记的大鼠单克隆抗体对CD24的鼠标，HSA的，然后在HSA和绿色荧光蛋白表达的流式细胞仪分析。
图1。如下所示，一个庞大的GFP人口VNL - GFP - RRE - SA（图1c）superinfected的HIV - 1感染细胞中检测到。与此相反，没有检测到GFP阳性细胞为HIV - 1的未受感染的CEM - SS的细胞中没有慢病毒重叠（图1a）或HIV - 1慢病毒重叠（图1b）未受感染的细胞。
Discussion
至于与早期开发的达依赖性表达载体，这里描述的是冯系统利用一个演变艾滋病毒过程。列入冯依赖呈现的LTR表达载体的高度依赖复制艾滋病毒的存在。这个向量的应用报道中，一个艾滋病毒相关的记者病毒，提供了全新的方式来确定艾滋病毒呈阳性的细胞。向量允许活细胞检查，可以表达任何基础或临床试验的基因，并作为一个伪类型的慢病毒已获得大多数细胞类型和组织。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持部分由公共卫生服务授予1R01AI081568从NIAID的YW M.罗森和第2天公司举办的2009年NYCDC艾滋病骑的捐助者和骑手的慷慨捐赠
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | |||
| 37°C 5%CO2 incubator | |||
| Flow cytometer | FACSCalibur | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allega®6KR | |
| 4°C regrigerator | |||
| -20°C refrigerator | |||
| -80°C refrigerator | |||
| Cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer® AutoT4 | |
| HEK293T cell line | National Institutes of Health | ||
| CEM-SS cell line | National Institutes of Health | ||
| Jurkat cell line J1.1 | National Institutes of Health | ||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | |
| HIV-1NL4-3 | prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA | ||
| pNL-GFP-RRE | copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3 | ||
| pNL-GFP-RRE-SA | Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE | ||
| pCMVΔ8.2 | provided by Dr. Dider Trono | ||
| pHCMV-G | |||
| 10 x HBS (Hepes Buffered Saline) | Invitrogen | 11344-041 | |
| 2M CaCl2 buffer | Invitrogen | S-013-154-10 | |
| 1% paraformaldehy | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Bleach | |||
| 50ml Falcon tubes | BD Biosciences | 358206 | |
| 5ml round bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 0.45μM Millipore filter | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 0.20μM Millipore filter | EMD Millipore | SLFG85000 | |
| 100mm Petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430588 | |
| Size-exclusion column (100,000MW cut off) | Sartorius AG | VS2041 | |
| 2ml frozen tube | Axygen Scientific | SCT-200 | |
| 96-well plate | BD Biosciences | 353227 | |
| 1.7mL Microcentrifuge Tube | Axygen Scientific | MCT- 175-C |
References
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