Summary
हम एक lentiviral वेक्टर है कि जैसे - उत्तरदायी लीटर के अलावा पास, विकसित किया है, Rev-प्रतिक्रिया (आरआरई) तत्व है कि एक एचआईवी -1 गूंथना और Rev पर निर्भर फैशन में रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति को विनियमित कर सकते हैं. वेक्टर GFP की अभिव्यक्ति के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में एचआईवी नकल की विशिष्ट पहचान परमिट.
Abstract
एचआईवी उत्तरदायी अभिव्यक्ति वैक्टर के अधिकांश एचआईवी प्रमोटर, लंबे टर्मिनल दोहराने (LTR) पर आधारित हैं. जबकि एक प्रारंभिक एचआईवी प्रोटीन, जैसे के लिए उत्तरदायी, LTR भी सेलुलर सक्रियण राज्यों और स्थानीय chromatin गतिविधि जहां एकीकरण हुआ है उत्तरदायी है. यह उच्च एचआईवी स्वतंत्र गतिविधि में परिणाम कर सकते हैं, और लीटर आधारित रिपोर्टर के निशान एचआईवी पॉजिटिव 1,2,3 कोशिकाओं उपयोगिता सीमित है. यहाँ, हम एक अभिव्यक्ति lentiviral वेक्टर है कि जैसे उत्तरदायी लीटर, कई एचआईवी डीएनए दृश्यों कि Rev-प्रतिक्रिया तत्व और एचआईवी splicing 4,5,6 साइटों में शामिल करने के लिए इसके अलावा में पास का निर्माण किया. सदिश एक lentiviral संवाददाता वायरस में शामिल किया गया था, जीवित कोशिका आबादी में एचआईवी नकल के अति विशिष्ट पता लगाने की अनुमति है. वेक्टर के गतिविधि हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) की अभिव्यक्ति के द्वारा मापा गया था. इस सदिश के आवेदन के रूप में यहां बताया एक उपन्यास विकल्प जैसे स्वस्थानी पीसीआर या एचआईवी प्रतिजन धुंधला में मौजूदा तरीकों के लिए, दृष्टिकोण, एचआईवी पॉजिटिव कोशिकाओं की पहचान प्रदान करता है. वेक्टर भी एचआईवी पॉजिटिव कोशिकाओं को लक्षित बुनियादी या नैदानिक प्रयोग के लिए चिकित्सकीय जीन व्यक्त कर सकते हैं.
Protocol
1. प्लास्मिड के Rev-निर्भर lentiviral कण के उत्पादन के लिए अभिकर्मक
सेट अप: Rev-निर्भर GFP lentiviral वेक्टर, PNL GFP-आरआरई-SA, 4,5,6 पहले वर्णित किया गया था. एक वायरल कण में इकट्ठा करने के लिए, प्लाज्मिड HEK293 टी कोशिकाओं में एचआईवी-1 पैकेजिंग का निर्माण, pCMVΔ8.2 (कृपया डॉ. Dider Trono द्वारा प्रदान) के साथ contransfected किया गया था, और एक प्लाज्मिड ग्लाइकोप्रोटीन VSV जी (pHCMV जी) ले जा . अभिकर्मक कैल्शियम फॉस्फेट विधि का उपयोग कर बाहर किया गया था.
Buffers की तैयारी: 10 एक्स HBS (Hepes खारा buffered) Hepes की 5 ग्राम भंग करके तैयार किया गया था, 8 NaCl जी, ना 2 4 HPO (निर्जल) के 0.37 KCl, 1 Dextrose की छ, .103 छ की 100 एमएल में छ एच 2 ओ विभाज्य the10 1 एमएल aliquots में एक्स HBS बफर और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान , और 7.05 के बीच पीएच को समायोजित - 7.12: अभिकर्मक के समय में, एच 2 हे (5 कमजोर पड़ने 1) के साथ 10 एक्स 2 एक्स HBS HBS कन्वर्ट . (10 एमएल 2 एक्स HBS के लिए, यह आमतौर पर 1M NaOH के लगभग 50 μL की आवश्यकता है). एक 0.22 सुक्ष्ममापी Millipore फिल्टर के माध्यम से गुजर 2X HBS बफर बाँझ फ़िल्टर. CaCl 2 बफर 10 मिमी Hepes में CaCl 2 अंतिम एकाग्रता 2M भंग द्वारा बनाया गया था. 5.8 पीएच समायोजित करने के लिए, फ़िल्टर बफर और 4 बजे दुकान बाँझ डिग्री सेल्सियस
प्रक्रिया:
- एक अभिकर्मक के लिए पहले दिन, 2 बीज x 10 एक 100 पेट्री पकवान मिमी में 6 HEK293T कोशिकाओं, और 37 पर 10 एमएल DMEM + 10% FBS में रातोंरात कोशिकाओं को विकसित ° सी, 5% सीओ 2.
- अगले दिन, कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला हटाने और 5 एमएल ताजा DMEM + 10% FBS, लगातार 4 घंटे के लिए संस्कृति कोशिकाओं के साथ बदलें.
- एक 5 एमएल polystyrene ट्यूब में 480 μL 2X HBS बफर जोड़ें.
- एक दूसरे 5 एमएल polystyrene ट्यूब में, 480 μL की कुल मात्रा 60 μL 2M CaCl 2 बफर, प्लास्मिड डीएनए, और अभिकर्मक ते बफर (1 मिमी Tris, 25 मिमी EDTA, पीएच 8.0) जोड़ें. प्रत्येक पेट्री डिश के लिए, plasmids PNL-GFP-आरआरई - एसए, pCMVΔR8.3 के 7.5 μg, और pHCMV जी का 2.5 मिलीग्राम के 10 μg के अनुपात में जोड़ा जाना चाहिए.
- प्लाज्मिड डीएनए CaCl 2 2 एक्स HBS ट्यूब dropwise मिश्रण जोड़ें, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. एक ठीक वेग फार्म होगा.
- विंदुक द्वारा कोशिकाओं को dropwise मिश्रण के 960 μL जोड़ें. रातोंरात 37 पर °% 5 सी, सीओ 2 सेते हैं.
- अगले दिन, सतह पर तैरनेवाला हटाने और 10 एमएल ताजा DMEM + 10% FBS जोड़ने के लिए, और लगातार 37 ° 5 सी,% सीओ रातोंरात 2 कोशिकाओं को सेते हैं.
- 48 घंटे के बाद अभिकर्मक कम फसल सतह पर तैरनेवाला हटाने और यह 50 एमएल बाँझ ट्यूबों में स्थानांतरित करके वायरस. प्रत्येक पेट्री डिश में ताजा 10 एमएल ताजा DMEM 10 +% FBS जोड़ें और रातोंरात संस्कृति को जारी. 4 में वायरस सतह पर तैरनेवाला स्टोर ° सी.
- सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करके 72 घंटे के बाद अभिकर्मक पर फसल के लिए जारी रखें. सभी supernatants का मिश्रण है, और 500 XG पर supernatants और गोली से 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सेल मलबे को हटाने.
- सतह पर तैरनेवाला एकत्र और थे एक 0.22 सुक्ष्ममापी Millipore फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड है. वायरस आगे आकार अपवर्जन स्तंभों के माध्यम से ध्यान केंद्रित किया गया था.
2. वायरल कणों को ध्यान लगाओ और वायरल टिटर निर्धारित
- किसी स्तंभ का आकार अपवर्जन (100,000 मेगावाट काट, Centricoin) द्वारा वायरल कणों केंद्रित थे. वायरल सतह पर तैरनेवाला स्तंभ में लोड किया गया था, और 4 ° 15 मिनट के लिए सी में 6000 XG centrifuged.
- एकत्र केंद्रित वायरल सतह पर तैरनेवाला aliquoted, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत
- वायरल टिटर TNF इलाज, एचआईवी-1 सकारात्मक जैकेट सेल लाइन, 7 J1.1 के संक्रमण के द्वारा निर्धारित किया गया था. कक्ष 2.5 x 5 एमएल प्रति 10 कोशिकाओं (100 एमएल कुल मात्रा) पर एक 96 अच्छी तरह से थाली में सुसंस्कृत थे, और एक सप्ताह के लिए 100 एमएल serially पतला vNL GFP-आरआरई-SA के साथ संक्रमित. कण के टिटर (TCID50) रीड और Muench 8 की विधि के बाद GFP सकारात्मक कुओं की गिनती द्वारा अनुमानित किया गया था.
3. चिह्नित एचआईवी lentiviral कण के साथ एक सकारात्मक कक्ष, vNL - GFP-आरआरई-SA
सेट अप: एक मानव CD4 टी सेल लाइन, CEM - एस एस, पहली बार एचआईवी -1 से संक्रमित किया गया था. 48 घंटे के बाद संक्रमण से कम कोशिकाओं lentiviral कणों, vNL GFP-आरआरई - एसए के साथ superinfected थे. एक और दो दिनों के लिए superinfection के बाद, GFP पॉजिटिव कोशिकाओं प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया गया. किसी नियंत्रण के रूप में, एचआईवी एक असंक्रमित CEM - एसएस कोशिकाओं समान vNL GFP-आरआरई-SA के साथ संक्रमित थे. केवल एचआईवी -1 से संक्रमित CEM एसएस कोशिकाओं GFP सकारात्मक कोशिकाओं को जन्म दिया नहीं बल्कि एचआईवी-1 असंक्रमित CEM एसएस कोशिकाओं.
प्रक्रिया:
- संक्रमण के दो घंटे पहले, एक अंतिम 4 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता polybrane जोड़ें. गणना कोशिकाओं और 2 एक्स 10 प्रत्येक संक्रमण के लिए 5 कोशिकाओं ले. एचआईवी -1 NL4-3 के 200 (p24) के 2 घंटे के लिए एनजी के साथ कोशिकाओं को संक्रमित.
- अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं में 10 मिनट के लिए 300 XG धुलाई, resuspend2 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल, और संस्कृति में 37 कोशिकाओं ° C 48 घंटे के लिए .
- गणना कोशिकाओं और 2 एक्स 10 vNL GFP-आरआरई-SA के साथ 5 संक्रमण के प्रति कोशिकाओं ले. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात vNL - GFP-आरआरई - एसए और सेते के 100 एमएल जोड़ें. कोशिकाओं को धो और 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल में resuspend .
- 48 घंटे के बाद superinfection में प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रदर्शन करना. संक्रमित कोशिकाओं pelleted और 500 एमएल 1% paraformaldehede, 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated में resuspended थे, और फिर एक FACScan विश्लेषक (Becton Dickenson) पर विश्लेषण.
4. प्रतिनिधि परिणाम
यदि प्रयोगों सफलतापूर्वक प्रदर्शन कर रहे हैं, एक बड़ा GFP आबादी प्रवाह cytometer द्वारा एचआईवी -1 से संक्रमित CEM एसएस कोशिकाओं में पाया जाएगा, जबकि नियंत्रण में, GFP सकारात्मक कोशिकाओं एचआईवी-1 असंक्रमित CEM - एसएस में पता नहीं होगा कोशिकाओं.
यदि प्रयोगों सफलतापूर्वक प्रदर्शन कर रहे हैं, रेव निर्भर lentiviral वेक्टर, vNL GFP-आरआरई-SA, सेल आबादी में रहने वाले हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन अभिव्यक्ति (GFP) के माप के माध्यम से नकल एचआईवी की अत्यधिक विशिष्ट पता लगाने की अनुमति होगी. इस उदाहरण में, काटा CEM - एसएस कोशिकाओं माउस CD24, HSA के खिलाफ एक चूहे पीई लेबल मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे, और फिर दोनों HSA और GFP अभिव्यक्ति के लिए एक प्रवाह cytometer पर विश्लेषण.
चित्रा 1 के रूप में यहाँ दिखाया गया है, एक बड़े आकार का GFP आबादी vNL - GFP-आरआरई एसए (चित्रा -1 सी) के साथ एचआईवी -1 से संक्रमित superinfected कोशिकाओं में पाया गया . इसके विपरीत, GFP सकारात्मक कोशिकाओं या तो एचआईवी -1 असंक्रमित CEM एसएस कोशिकाओं में lentiviral (चित्रा 1a) superinfection या एचआईवी 1 lentiviral superinfection (चित्रा 1b) के साथ असंक्रमित कोशिकाओं के बिना नहीं पाया गया
Discussion
पहले विकसित गूंथना निर्भर अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ के रूप में, Rev प्रणाली यहाँ वर्णित है एक विकसित एचआईवी प्रक्रिया के शोषण. Rev निर्भरता का समावेश renders लीटर आधारित अभिव्यक्ति वेक्टर अत्यधिक नकल एचआईवी की उपस्थिति पर निर्भर है. इस सदिश के आवेदन के रूप में यहाँ की सूचना दी, एक रिपोर्टर एचआईवी निर्भर वायरस, एचआईवी पॉजिटिव कोशिकाओं की पहचान के लिए एक उपन्यास नया दृष्टिकोण प्रदान करता है. वेक्टर जीवित कोशिकाओं की परीक्षा परमिट, बुनियादी या नैदानिक प्रयोग के लिए किसी भी जीन व्यक्त कर सकते हैं और एक छद्म टाइप lentivirus रूप में सबसे सेल प्रकार और ऊतकों के लिए उपयोग किया है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
काम के हिस्से में सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा अनुदान NIAID से YW 1R01AI081568 और दाताओं और 2009 NYCDC एड्स की सवारी के सवार एम. रोजेन और Day2 इंक द्वारा आयोजित की उदार दान के द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | |||
| 37°C 5%CO2 incubator | |||
| Flow cytometer | FACSCalibur | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allega®6KR | |
| 4°C regrigerator | |||
| -20°C refrigerator | |||
| -80°C refrigerator | |||
| Cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer® AutoT4 | |
| HEK293T cell line | National Institutes of Health | ||
| CEM-SS cell line | National Institutes of Health | ||
| Jurkat cell line J1.1 | National Institutes of Health | ||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | |
| HIV-1NL4-3 | prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA | ||
| pNL-GFP-RRE | copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3 | ||
| pNL-GFP-RRE-SA | Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE | ||
| pCMVΔ8.2 | provided by Dr. Dider Trono | ||
| pHCMV-G | |||
| 10 x HBS (Hepes Buffered Saline) | Invitrogen | 11344-041 | |
| 2M CaCl2 buffer | Invitrogen | S-013-154-10 | |
| 1% paraformaldehy | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Bleach | |||
| 50ml Falcon tubes | BD Biosciences | 358206 | |
| 5ml round bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 0.45μM Millipore filter | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 0.20μM Millipore filter | EMD Millipore | SLFG85000 | |
| 100mm Petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430588 | |
| Size-exclusion column (100,000MW cut off) | Sartorius AG | VS2041 | |
| 2ml frozen tube | Axygen Scientific | SCT-200 | |
| 96-well plate | BD Biosciences | 353227 | |
| 1.7mL Microcentrifuge Tube | Axygen Scientific | MCT- 175-C |
References
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