Summary
Nous avons développé un vecteur lentiviral qui possède, en plus de la LTR-Tat réactif, l'élément de réponse Rev-(RRE) qui peuvent réguler l'expression du gène rapporteur de façon à VIH-1 Tat et Rev-dépendante. Le vecteur permet la détection spécifique de la réplication du VIH dans les cellules vivantes via l'expression de la GFP.
Abstract
La plupart des vecteurs d'expression du VIH-réactive sont basées sur le promoteur du VIH, la longue répétition terminale (LTR). Alors que réactive à une protéine précoce du VIH, Tat, le LTR est également sensible aux états d'activation cellulaire et à l'activité locale chromatine où l'intégration a eu lieu. Cela peut aboutir à VIH est élevée indépendante activité, et a restreint l'utilité de la LTR-journaliste basée à marquer les cellules séropositifs 1,2,3. Ici, nous avons construit un vecteur d'expression lentiviral qui possède, en plus de la LTR-Tat réactive, de nombreuses séquences d'ADN du VIH qui inclut l'élément Rev-réponse et des sites d'épissage du VIH 4,5,6. Le vecteur a été incorporée dans un virus journaliste lentiviraux, permettant une détection très spécifique de répliquer le VIH dans les populations de cellules vivantes. L'activité du vecteur a été mesurée par l'expression de la protéine à fluorescence verte (GFP). L'application de ce vecteur comme indiqué ici, propose une approche nouvelle alternative aux méthodes existantes, telles que la PCR in situ ou la coloration antigène du VIH, d'identifier les séropositifs cellules. Le vecteur peut également exprimer des gènes thérapeutiques pour l'expérimentation fondamentale ou clinique pour cibler le VIH-positives cellules.
Protocol
1. La transfection de plasmides pour la production des particules Rev-dépendante lentiviraux
Mettre en place: Le Rev-dépendante GFP lentiviraux vecteur, PNL-GFP-RRE-SA, a été décrit précédemment 4,5,6. Pour assembler dans une particule virale, le plasmide a été contransfected dans les cellules HEK293 T avec le VIH-1 construit emballage, pCMVΔ8.2 (aimablement fourni par le Dr Didier Trono), et un plasmide portant la glycoprotéine de VSV-G (pHCMV-G) . La transfection a été réalisée en utilisant la méthode au phosphate de calcium.
Préparation des tampons: 10 X HBS (Hepes Buffered Saline) a été préparée en dissolvant 5 g de Hepes, 8 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 1 g de dextrose, 0,103 g de Na 2 HPO 4 (anhydre) dans 100 ml de H 2 O. Aliquoter the10 X tampon HBS en aliquotes de 1 ml et conserver à -20 ° C. Au moment de la transfection, de convertir les 10 X 2 X pour HBS HBS avec H 2 O (1: 5 dilution), et ajuster le pH entre 7.5 à 7.12. (Pour 10 ml de HBS 2 X, il faut habituellement environ 50 uL de NaOH 1M). Stériliser par filtration le tampon HBS 2X en passant par un filtre Millipore 0,22 um. CaCl 2 tampon a été faite en dissolvant CaCl 2 dans 10 mM Hepes à une concentration finale 2M. Ajuster le pH à 5,8, stériliser par filtration le tampon et stocker à 4 ° C.
Procédure:
- Un jour avant la transfection, les graines de 2 x 10 6 cellules HEK293T dans un 100 mm boîte de Petri, et cultiver des cellules pendant la nuit dans 10 ml de FBS DMEM + 10% à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Le lendemain, retirer le surnageant des cellules et la remplacer par 5 ml DMEM frais FBS + 10%, les cellules de culture en continu pendant 4 heures.
- Dans un tube en polystyrène de 5 mL, ajouter 480 uL du tampon HBS 2X.
- Dans un deuxième tube de 5 ml en polystyrène, ajouter 60 uL 2M CaCl 2 tampon, l'ADN plasmidique, et la transfection de tampon TE (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8,0) à un volume total de 480 ul. Pour chaque boîte de Petri, les plasmides devrait être ajouté dans le rapport de 10 ug de PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 ug d'pCMVΔR8.3, et 2,5 mg de pHCMV-G.
- Ajouter l'ADN plasmidique-CaCl2 mélange goutte à goutte au tube 2 X HBS, et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Un fin précipité se forme.
- Ajoutez les 960 uL du mélange goutte à goutte à la pipette pour les cellules. Incuber à 37 ° C CO, 5% 2 la nuit.
- Le lendemain, retirer le surnageant et ajouter 10 ml DMEM frais + 10% de FBS, et continuellement incuber les cellules à 37 ° C CO, 5% 2 la nuit.
- À 48 heures après la transfection, la récolte du virus en supprimant le surnageant et le transférer dans des tubes de 50 ml stérile. Ajouter 10 ml douce fraîcheur FBS DMEM + 10% dans chaque boîte de Petri et de continuer à la culture pendant la nuit. Stocker le surnageant de virus à 4 ° C.
- Continuez à récolter moins 72 heures après la transfection par la collecte du surnageant. Mélanger tous les surnageants, et centrifuger le surnageant à 500 xg pendant 15 minutes à granulés et à éliminer les débris cellulaires.
- Le surnageant ont été collectées et filtrées à travers un filtre Millipore 0,22 um. Le virus a été davantage concentrées dans les colonnes d'exclusion de taille.
2. Concentrer les particules virales et de déterminer le titre viral
- Les particules virales ont été concentrés par une colonne d'exclusion de taille (100 000 MW coupés, Centricoin). Surnageant viral a été chargée dans la colonne, et centrifugé à 6000 xg à 4 ° C pendant 15 minutes.
- Concentrée surnageant viral ont été recueillis, aliquotés et conservés à -80 ° C.
- Le titre viral a été déterminé par infection d'un TNF-traitée, le VIH-1 en ligne Veste de cellules positives, J1.1 7. Les cellules ont été cultivées dans une plaque 96 puits à 2,5 x 10 5 cellules par ml (100 ml de volume total), et infectées avec 100 ml d'dilué en série VNL-GFP-RRE-SA pour une semaine. Le titre (DICT50) de la particule a été estimée en comptant le puits GFP-positives en suivant la méthode de Reed et Muench 8.
3. Marquage au VIH-1 des cellules positives avec la particule lentiviraux, VNL-GFP-RRE-SA
Mettre en place: une lignée humaine de cellules CD4 T, CEM-SS, a d'abord été infectées par le VIH-1. À 48 heures après l'infection, les cellules sont surinfectées avec les particules lentiviraux, VNL-GFP-RRE-SA. Suite à une surinfection par une autre deux jours, GFP-positives cellules ont été analysées par cytométrie en flux. Comme contrôle, le VIH-1 CEM-SS infectées cellules ont été infectées par l'identique VNL-GFP-RRE-SA. Seul le VIH-1-CEM-SS infectées cellules ont donné naissance à des cellules GFP-positives mais pas le VIH-1 non infecté les cellules CEM-SS.
Procédure:
- Deux heures avant l'infection, ajouter polybrane à une concentration finale de 4 mg / ml. Compter les cellules et de prendre 2 x 10 5 cellules pour chaque infection. Infecter les cellules avec 200 ng (p24) du VIH-1 NL4-3 pendant 2 heures.
- Lavage des cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 minutes, resuspendrecellules en 2 x 10 5 cellules / ml, et la culture à 37 ° C pendant 48 heures.
- Compter les cellules et de prendre 2 x 10 5 cellules par infection avec VNL-GFP-RRE-SA. Ajouter 100 ml de VNL-GFP-RRE-SA et incuber à 37 ° C pendant la nuit. Laver les cellules et remettre en 2 x 10 5 cellules / ml.
- Effectuer une analyse de cytométrie en flux à 48 heures après la surinfection. Les cellules infectées ont été sédimentées et remises en suspension dans 500 ml paraformaldehede 1%, incubées à température ambiante pendant 20 minutes, puis analysés sur un analyseur FACScan (Becton Dickinson).
4. Les résultats représentatifs
Si les expériences sont réalisées avec succès, une population importante GFP sera détecté par le VIH-1-CEM-SS infectées cellules par le cytomètre en flux, alors que, dans le contrôle, les cellules GFP-positives ne seront pas détectés par le VIH-1 infectées CEM-SS cellules.
Si les expériences sont réalisées avec succès, le vecteur lentiviral Rev-dépendante, VNL-GFP-RRE-SA, permettra la détection hautement spécifique de la réplication du VIH dans la vie des populations de cellules, grâce à la mesure de la protéine verte (GFP) l'expression de fluorescence. Dans cet exemple, la récolte des cellules CEM-SS ont été colorées avec un anticorps de rat PE-étiquetées monoclonaux contre la souris CD24, HSA, puis analysés sur un cytomètre en flux pour les deux HSA et expression de la GFP.
Figure 1. Comme le montre ici, une population importante GFP a été détecté dans le VIH-1 aux cellules infectées surinfectées VNL-GFP-RRE-SA (figure 1c). En revanche, les cellules GFP-positives n'ont pas été détectés dans les deux non infectés au VIH-1 des cellules CEM-SS, sans surinfection lentiviraux (figure 1a) ou du VIH-1 aux cellules non infectées surinfection lentiviraux (figure 1b).
Discussion
Comme avec les vecteurs d'expression précédemment développés Tat-dépendants, le système Rev décrit ici est une exploitation d'un procédé évolué VIH. L'inclusion de Rev-dépendance rend le vecteur d'expression LTR-base dépend fortement de la présence de répliquer le VIH. L'application de ce vecteur tel que rapporté ici, un virus VIH-journaliste à charge, offre une nouvelle approche pour identifier de nouveaux séropositifs cellules. Le vecteur permet l'examen des cellules vivantes, peuvent exprimer n'importe quel gène d'expérimentation fondamentale ou clinique, et comme un lentivirus pseudo tapé a accès à la plupart des types de cellules et les tissus.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le travail a été soutenu en partie par Service de santé publique accorde 1R01AI081568 du NIAID à YW et par les dons généreux des donateurs et des cavaliers du Carrousel 2009 NYCDC sida organisée par M. Rosen et Day2 Inc
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | |||
| 37°C 5%CO2 incubator | |||
| Flow cytometer | FACSCalibur | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allega®6KR | |
| 4°C regrigerator | |||
| -20°C refrigerator | |||
| -80°C refrigerator | |||
| Cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer® AutoT4 | |
| HEK293T cell line | National Institutes of Health | ||
| CEM-SS cell line | National Institutes of Health | ||
| Jurkat cell line J1.1 | National Institutes of Health | ||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | |
| HIV-1NL4-3 | prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA | ||
| pNL-GFP-RRE | copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3 | ||
| pNL-GFP-RRE-SA | Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE | ||
| pCMVΔ8.2 | provided by Dr. Dider Trono | ||
| pHCMV-G | |||
| 10 x HBS (Hepes Buffered Saline) | Invitrogen | 11344-041 | |
| 2M CaCl2 buffer | Invitrogen | S-013-154-10 | |
| 1% paraformaldehy | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Bleach | |||
| 50ml Falcon tubes | BD Biosciences | 358206 | |
| 5ml round bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 0.45μM Millipore filter | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 0.20μM Millipore filter | EMD Millipore | SLFG85000 | |
| 100mm Petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430588 | |
| Size-exclusion column (100,000MW cut off) | Sartorius AG | VS2041 | |
| 2ml frozen tube | Axygen Scientific | SCT-200 | |
| 96-well plate | BD Biosciences | 353227 | |
| 1.7mL Microcentrifuge Tube | Axygen Scientific | MCT- 175-C |
References
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- Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects. AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).
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- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
