Summary
Wir haben einen lentiviralen Vektor, besitzt neben dem Tat-responsive LTR entwickelt, das Rev-Response-Element (RRE), dass die Expression des Reportergens in einer HIV-1 Tat-und Rev-abhängigen Weise regulieren können. Der Vektor erlaubt den spezifischen Nachweis von HIV Replikation in lebenden Zellen über die Expression von GFP.
Abstract
Die meisten HIV-responsive Expressionsvektoren sind die HIV-Promotor, die long terminal repeat (LTR) basiert. Während in Reaktion auf eine frühe HIV-Protein, Tat, ist der LTR reagiert auch auf zelluläre Aktivierung Staaten und den lokalen Chromatin, in denen die Integration stattgefunden hat. Dies kann in hohen HIV-selbständigen Tätigkeit ergeben, und hat beschränkt die Nützlichkeit von LTR-based-Reporter zu markieren HIV-positive Zellen 1,2,3. Hier bauten wir einen Ausdruck lentiviralen Vektor, besitzt neben dem Tat-responsive LTR, zahlreiche HIV DNA-Sequenzen, die Rev-Response-Element und HIV-Spleißstellen 4,5,6 gehören. Der Vektor wurde in einem lentiviralen Reporter Virus eingebaut, ermöglicht hochspezifischen Nachweis der Replikation von HIV in lebenden Zell-Populationen. Die Aktivität des Vektors wurde durch die Expression des grün fluoreszierendes Protein (GFP) gemessen. Die Anwendung dieses Vektors wie hier berichtet bietet eine neuartige Alternative Ansatz, bestehende Methoden wie in-situ-PCR oder HIV-Antigen-Färbung, um HIV-positive Zellen zu identifizieren. Der Vektor kann auch Ausdruck therapeutische Gene für Grundlagen-oder klinischen Versuche zur HIV-positive Zielzellen.
Protocol
1. Die Transfektion von Plasmiden für die Produktion von Rev-abhängige Lentivirale Partikel
Set up: Die Rev-abhängige GFP lentiviralen Vektor, PNL-GFP-RRE-SA, war zuvor 4,5,6 beschrieben. Zur Montage in einen viralen Partikel wurde das Plasmid in HEK293-Zellen mit einer HIV-1-Verpackung zu konstruieren, pCMVΔ8.2 (freundlicherweise von Dr. Dider Trono zur Verfügung gestellt) contransfected und ein Plasmid, das VSV-G-Glykoprotein (pHCMV-G) . Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Calcium-Phosphat-Methode durchgeführt.
Herstellung der Puffer: 10 X HBS (HEPES-gepufferte Saline) wurde durch Auflösen von 5 g Hepes vorbereitet, 8 g NaCl, 0,37 g KCl, 1 g Dextrose, 0,103 g Na 2 HPO 4 (wasserfrei) in 100 ml H 2 O. Aliquot Die10 X HBS-Puffer in 1 mL Aliquots und bei -20 ° C. Zum Zeitpunkt der Transfektion, konvertieren Sie die 10 X HBS bis 2 X HBS mit H 2 O (1: 5 Verdünnung) und den pH-Wert zwischen 7,05 bis 7,12. (Für 10 mL 2 X HBS, es erfordert in der Regel etwa 50 ul 1M NaOH). Filter sterilisieren 2X HBS-Puffer, indem sie durch ein 0,22 um Millipore-Filter. CaCl 2-Puffer wurde durch Lösen von CaCl 2 in 10 mM Hepes, um eine Endkonzentration 2M gemacht. Der pH-Wert auf 5,8, Filter sterilisieren Puffer und lagern bei 4 ° C.
Vorgehensweise:
- Einen Tag vor der Transfektion, Samen 2 x 10 6 HEK293T Zellen in einer 100 mm Petri-Schale, und wachsen Zellen über Nacht in 10 mL DMEM + 10% FBS bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Am nächsten Tag entfernen Überstand von Zellen und ersetzen mit 5 ml frisches DMEM + 10% FBS, kontinuierlich Kultur-Zellen für 4 Stunden.
- In einer 5-ml Polystyrol Röhrchen, fügen Sie 480 ul 2X HBS-Puffer.
- In einem zweiten 5 ml Polystyrol Röhrchen, mit 60 ul 2M CaCl 2-Puffer, die Plasmid-DNA und Transfektion TE-Puffer (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8,0) auf ein Gesamtvolumen von 480 ul. Für jede Petri-Schale, sollte Plasmiden in das Verhältnis von 10 ug PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 pg pCMVΔR8.3 und 2,5 mg pHCMV-G hinzugefügt werden.
- Fügen Sie die Plasmid-DNA-CaCl 2-Gemisch tropfenweise zu der 2 X HBS Rohr, und Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Ein feiner Niederschlag bilden.
- Fügen Sie die 960 ul der Mischung mit einer Pipette auf die Zellen getropft. Bei 37 ° C, 5% CO 2 über Nacht.
- Am nächsten Tag, entfernen Sie den Überstand und 10 ml frisches DMEM + 10% FBS und kontinuierlich Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 über Nacht.
- Nach 48 Stunden nach der Transfektion, Ernte des Virus durch das Entfernen des Überstandes und Überführung in 50 mL sterilen Röhrchen. Add frischen 10 ml frisches DMEM + 10% FBS in jede Petri-Schale und weiterhin Kultur über Nacht. Bewahren Sie die Virus-Überstand bei 4 ° C.
- Fahren Sie mit bei 72 Stunden nach der Transfektion durch das Sammeln der Überstand Ernte. Kombinieren Sie all die Überstände und Zentrifuge die Überstände bei 500 xg für 15 Minuten, um Pellets und entfernen Zelltrümmer.
- Der Überstand wurde gesammelt und durch ein 0,22 um Millipore-Filter filtriert. Das Virus wurde weiter durch Ausschluss-Säulen konzentriert.
2. Konzentrieren Sie sich Viruspartikel und Bestimmen Virustiter
- Viralen Partikel wurden durch ein Ausschluss-Spalte (100.000 MW abgeschnitten, Centricoin) konzentriert. Viral Überstand wurde in die Säule geladen und zentrifugiert bei 6.000 xg bei 4 ° C für 15 Minuten.
- Konzentrierte virale Überstand wurde gesammelt, aliquotiert und bei -80 ° C.
- Der virale Titer wurde durch Infektion eines TNF-behandelten HIV-1-positiven Jacket Zelllinie, J1.1 7 bestimmt. Die Zellen wurden in einer 96-Well-Platte bei 2,5 x 10 5 Zellen pro mL (100 mL Gesamtvolumen) kultiviert und infiziert mit 100 ml seriell verdünnt VNL-GFP-RRE-SA für eine Woche. Der Titer (TCID50) des Teilchens wurde durch Zählen der GFP positiven Vertiefungen nach der Methode von Reed und Muench 8 geschätzt.
3. Kennzeichnung HIV-1 positiven Zellen mit dem Lentivirale Partikel, VNL-GFP-RRE-SA
Set up: ein menschliches CD4 T-Zell-Linie, CEM-SS, wurde zum ersten Mal mit HIV-1 infiziert. Bei 48 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen mit dem lentiviralen Partikeln, VNL-GFP-RRE-SA Superinfektion. Nach Superinfektion für weitere zwei Tagen wurden GFP-positive Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Als Kontrolle HIV-1 infizierten CEM-SS-Zellen wurden identisch mit VNL-GFP-RRE-SA infiziert. Nur die HIV-1-infizierten CEM-SS-Zellen führte zu GFP-positiven Zellen, nicht aber die HIV-1 infizierten CEM-SS-Zellen.
Vorgehensweise:
- Zwei Stunden vor der Infektion, fügen polybrane bis zu einer Endkonzentration von 4 mg / mL. Zählen von Zellen und nehmen Sie 2 x 10 5 Zellen für jede Infektion. Infect Zellen mit 200 ng (p24) von HIV-1 NL4-3 für 2 Stunden.
- Waschen der Zellen durch Zentrifugieren bei 300 xg für 10 Minuten, resuspendierenZellen in 2 x 10 5 Zellen / ml und bei 37 ° C für 48 Stunden.
- Zählen von Zellen und nehmen Sie 2 x 10 5 Zellen pro Infektion mit VNL-GFP-RRE-SA. Add 100 ml VNL-GFP-RRE-SA und bei 37 ° C über Nacht. Wash-Zellen und Zellen in 2 x 10 5 Zellen / ml.
- Führen Durchflusszytometrie 48 Stunden nach Superinfektion. Die infizierten Zellen wurden pelletiert und in 500 ml 1% paraformaldehede, bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert, und dann auf einem FACScan-Analysator (Becton Dickenson) analysiert.
4. Repräsentative Ergebnisse
Wenn die Versuche erfolgreich durchgeführt werden, wird eine beträchtliche GFP Bevölkerung in HIV-1-infizierten CEM-SS-Zellen durch das Durchflusszytometer nachgewiesen werden, wohingegen in der Kontrollgruppe, GFP-positive Zellen werden nicht in HIV-1 infizierten CEM-SS erkannt werden Zellen.
Wenn die Versuche erfolgreich durchgeführt werden, die Rev-abhängige lentiviralen Vektor, VNL-GFP-RRE-SA wird die hochspezifischen Nachweis der Replikation von HIV in lebenden Zell-Populationen zu ermöglichen, durch Messung der grünen Fluoreszenz-Protein (GFP) Ausdruck. In diesem Beispiel wurden geerntet CEM-SS-Zellen mit einem PE-markiertem Ratte monoklonale Antikörper gegen Maus-CD24, HSA gebeizt und dann mit einem Durchflusszytometer für HSA und GFP-Expression analysiert.
Abbildung 1. Wie hier gezeigt, eine beträchtliche GFP Bevölkerung war in HIV-1-infizierten Zellen mit VNL-GFP-RRE-SA (Abbildung 1c) superinfiziert erkannt. Im Gegensatz dazu waren GFP-positiven Zellen weder in HIV-1 infizierten CEM-SS-Zellen ohne lentiviralen Superinfektion (Abbildung 1a) oder HIV-1 infizierten Zellen mit lentiviralen Superinfektion (Abb. 1b). Festgestellt
Discussion
Wie bei den früher entwickelten Tat-abhängigen Expressionsvektoren beschrieben, die Rev-System ist hier eine Ausbeutung eines entwickelten HIV-Prozess. Die Einbeziehung von Rev-Abhängigkeit macht die LTR-basierten Expressionsvektor in hohem Maße von der Anwesenheit der Replikation von HIV. Die Anwendung dieses Vektors wie hier berichtet, ein HIV-abhängigen Reporter-Virus bietet eine neuartige neuen Ansatz zur HIV-positive Zellen zu identifizieren. Der Vektor erlaubt Untersuchung von lebenden Zellen, ausdrücken kann jedes Gen für Grundlagen-oder klinischen Erprobung, und als pseudo-typed Lentivirus hat Zugang zu den meisten Zelltypen und Geweben.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde teilweise durch Public Health Service gewähren 1R01AI081568 von NIAID auf YW und durch die großzügigen Spenden der Spender und Fahrer der 2009 dann den Mietvertrag zugesandt AIDS Ride von M. Rosen und Day2 Inc. organisiert unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | |||
| 37°C 5%CO2 incubator | |||
| Flow cytometer | FACSCalibur | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allega®6KR | |
| 4°C regrigerator | |||
| -20°C refrigerator | |||
| -80°C refrigerator | |||
| Cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer® AutoT4 | |
| HEK293T cell line | National Institutes of Health | ||
| CEM-SS cell line | National Institutes of Health | ||
| Jurkat cell line J1.1 | National Institutes of Health | ||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | |
| HIV-1NL4-3 | prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA | ||
| pNL-GFP-RRE | copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3 | ||
| pNL-GFP-RRE-SA | Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE | ||
| pCMVΔ8.2 | provided by Dr. Dider Trono | ||
| pHCMV-G | |||
| 10 x HBS (Hepes Buffered Saline) | Invitrogen | 11344-041 | |
| 2M CaCl2 buffer | Invitrogen | S-013-154-10 | |
| 1% paraformaldehy | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Bleach | |||
| 50ml Falcon tubes | BD Biosciences | 358206 | |
| 5ml round bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 0.45μM Millipore filter | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 0.20μM Millipore filter | EMD Millipore | SLFG85000 | |
| 100mm Petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430588 | |
| Size-exclusion column (100,000MW cut off) | Sartorius AG | VS2041 | |
| 2ml frozen tube | Axygen Scientific | SCT-200 | |
| 96-well plate | BD Biosciences | 353227 | |
| 1.7mL Microcentrifuge Tube | Axygen Scientific | MCT- 175-C |
References
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- Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects. AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).
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- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
