Summary
Vi har utvecklat en Lentiviral vektor som har, utöver de Tat-lyhörd LTR, REV-respons element (RRE) som kan reglera uttrycket reporter genen i en HIV-1 Tat-och Rev-beroende sätt. Vektorn medger detektering av replikera hiv i levande celler genom uttryck av GFP.
Abstract
De flesta av HIV-lyhörd expressionsvektorer är baserade på hiv-promotorn, den långa terminala repetera (LTR). Medan lyhörda för en tidig HIV-protein, Tat, är LTR också lyhörd för cellulär aktivering stater och till den lokala kromatin aktivitet där integrationen har inträffat. Detta kan resultera i hög hiv-oberoende aktivitet, och har begränsat nyttan av LTR-baserad reporter för att markera hiv-positiva celler 1,2,3. Här byggde vi ett uttryck Lentiviral vektor som har, utöver de Tat-lyhörd LTR, många HIV-DNA-sekvenser som innehåller Rev-respons element och hiv webbplatser skarvning 4,5,6. Vektorn införlivades en Lentiviral reporter virus, vilket möjliggör mycket specifika upptäcka replikera hiv i levande cell populationer. Aktiviteten av vektorn mättes med uttryck av grön fluorescens protein (GFP). Tillämpningen av denna vektor som rapporterats här erbjuder ett nytt alternativ till befintliga metoder, till exempel in situ PCR-eller HIV-antigen färgning, för att identifiera hiv-positiva celler. Vektorn kan också uttrycka terapeutiska gener för grundläggande och kliniska försök att rikta hiv-positiva celler.
Protocol
1. Transfektion av plasmider för produktion av Rev-beroende Lentiviral Particles
Ställ upp: Rev-beroende GFP Lentiviral vektor, PNL-GFP-RRE-SA, beskrevs tidigare 4,5,6. Att montera in en viral partikel var plasmiden contransfected i HEK293 T-celler med en HIV-1 förpackning konstruera, pCMVΔ8.2 (vänligt tillhandahålls av Dr Dider Trönö), och en plasmid som bär VSV-G glykoprotein (pHCMV-G) . Den transfektion utfördes med metoden kalciumfosfat.
Beredning av buffertar: 10 x HBS (Hepes koksaltlösning) förbereddes genom att lösa upp 5 g av Hepes, 8 g NaCl, 0,37 g KCl, 1 g dextros, 0,103 g Na 2 HPO 4 (vattenfri) i 100 ml H 2 O. Alikvotera the10 X HBS bufferten i 1 mL alikvoter och förvara vid -20 ° C. Vid tidpunkten för transfektion, konvertera 10 X HBS till 2 x HBS med H 2 O (1: 5 utspädning), och justera pH till mellan 7,05 till 7,12. (För 10 ml 2 X HBS, det kräver oftast omkring 50 mikroliter av 1M NaOH). Filtrera sterilisera 2X HBS bufferten genom att passera genom ett 0,22 mikroM Millipore filter. CaCl 2 buffert gjordes genom att lösa CaCl 2 i 10 mM Hepes till en slutlig koncentration 2M. Justera pH till 5,8, filtrera sterilisera bufferten och förvara vid 4 ° C.
Förfarande:
- En dag före transfektion, utsäde 2 x 10 6 HEK293T celler i en 100 mm Petri-skålen, och växa celler över natten i 10 ml DMEM + 10% FBS vid 37 ° C, 5% CO 2.
- Nästa dag, ta bort supernatanten från celler och ersätta med 5 ml färsk DMEM + 10% FBS, kontinuerligt kultur celler i 4 timmar.
- I en 5 ml polystyren röret, lägg till 480 mikroliter 2X HBS buffert.
- I en andra 5 mL polystyren röret, lägg till 60 mikroliter 2M CaCl 2 buffert, den plasmid DNA och transfektion TE buffert (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8,0) till en total volym på 480 mikroliter. För varje Petri-skålen, bör plasmider läggas till i förhållandet 10 mikrogram av PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 mikrogram pCMVΔR8.3 och 2,5 mg pHCMV-G.
- Lägg till plasmid-DNA-CaCl 2 blandningen droppvis till 2 X HBS rör och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter. En fin fällning bildas.
- Tillsätt 960 mikroliter av blandningen droppvis med pipett till cellerna. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 över en natt.
- Nästa dag, avlägsna supernatanten och tillsätt 10 ml färska DMEM + 10% FBS och ständigt inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO 2 över en natt.
- Vid 48 timmar efter transfektion, skörd viruset genom att ta bort supernatanten och överför den till 50 mL sterila rör. Tillsätt färska 10 ml färsk DMEM + 10% FBS till varje Petri-skålen och fortsätter till kultur över en natt. Förvara viruset supernatanten vid 4 ° C.
- Fortsätter att skörda vid 72 timmar efter transfektion genom att samla in supernatanten. Kombinera alla supernatanterna och centrifugera supernatanterna vid 500 xgi 15 minuter till pellets och ta bort celler skräp.
- Supernatanten samlades in och filtreras genom ett 0,22 mikroM Millipore filter. Viruset ytterligare koncentreras genom storlek utanförskap kolumner.
2. Koncentrera viruspartiklar och bestämma Viral titer
- Viruspartiklar koncentrerades av en storlek-utanförskap kolumn (100.000 MW avskuren, Centricoin). Viral supernatanten lastades in i kolonnen och centrifugeras vid 6000 xg vid 4 ° C i 15 minuter.
- Koncentrerad virala supernatanten samlades in, alikvoteras och förvaras vid -80 ° C.
- Den virala titer bestämdes av infektion i en TNF-behandlade, HIV-1 positiva Jacka cellinje, J1.1 7. Cellerna odlades i 96 brunnar på 2,5 x 10 5 celler per ml (100 ml totala volymen), och infekterade med 100 ml serie utspädd VNL-GFP-RRE-SA i en vecka. Den titer (TCID50) av partikel uppskattades genom att räkna GFP-positiva brunnar enligt den metod för Reed och Muench 8.
3. Märkning HIV-1-positiva celler med Lentiviral partikelfysik, VNL-GFP-RRE-SA
Ställ in: en människa CD4 T-cell linje, CEM-SS, var först infekterade med HIV-1. På 48 timmar efter infektion, var cellerna superinfected med Lentiviral Particles, VNL-GFP-RRE-SA. Efter superinfektion i ytterligare två dagar, var GFP-positiva celler analyseras med flödescytometri. Som en kontroll, HIV-1 var oinfekterade CEM-SS cellerna identiskt infekterade med VNL-GFP-RRE-SA. Endast HIV-1-infekterade CEM-SS celler gav upphov till GFP positiva celler men inte HIV-1 infekterade CEM-SS celler.
Förfarande:
- Två timmar innan infektionen, lägga polybrane till en slutlig koncentration 4 mg / ml. Räkna celler och tar 2 x 10 5 celler för varje infektion. Infektera celler med 200 ng (p24) av HIV-1 NL4-3 i 2 timmar.
- Tvätt cellerna genom centrifugering vid 300 xgi 10 minuter, resuspenderaceller till 2 x 10 5 celler / ml och kultur vid 37 ° C i 48 timmar.
- Räkna celler och tar 2 x 10 5 celler per infektion med VNL-GFP-RRE-SA. Tillsätt 100 ml VNL-GFP-RRE-SA och inkubera vid 37 ° C över natten. Tvätta cellerna och återsuspendera i 2 x 10 5 celler / ml.
- Utför analys flödescytometri vid 48 timmar efter superinfektion. Infekterade celler var pelleterad och återsuspenderade i 500 ml 1% paraformaldehede, inkuberas i rumstemperatur i 20 minuter och sedan analyseras på ett FACScan analysator (Becton Dickenson).
4. Representativa resultat
Om försöken med godkänt resultat, kommer en betydande GFP befolkning påvisas i HIV-1-infekterade CEM-SS celler genom flödescytometern, medan i kontrollgruppen, kommer GFP positiva celler inte kan påvisas i HIV-1 infekterade CEM-SS celler.
Om försöken med godkänt resultat på Rev-beroende Lentiviral vektor, VNL-GFP-RRE-SA, kommer att tillåta mycket specifik detektion av replikera hiv i levande cell populationer, genom mätning av grön fluorescens protein (GFP) uttryck. I detta exempel skördades CEM-SS celler färgas med ett PE-märkt råtta monoklonal antikropp mot mus CD24, HSA, och sedan analyseras på en flödescytometer för både HSA och GFP uttryck.
Figur 1. Som du ser här, var en ansenlig GFP population upptäcktes i HIV-1-infekterade celler superinfected med VNL-GFP-RRE-SA (Figur 1c). Däremot var GFP positiva celler inte upptäcks i antingen HIV-1 infekterade CEM-SS celler utan Lentiviral superinfektion (Figur 1a) eller HIV-1-infekterade celler med Lentiviral superinfektion (Figur 1b).
Discussion
Som med de tidigare utvecklade Tat-beroende expressionsvektorer beskrev varven systemet här är ett utnyttjande av ett utvecklat HIV-process. Införandet av Rev-beroende gör LTR-baserade uttryck vektor starkt beroende av förekomsten av replikera hiv. Tillämpningen av denna vektor som rapporterats här, en HIV-beroende reporter virus, erbjuder en ny ny metod för att identifiera hiv-positiva celler. Vektorn tillåter granskning av levande celler kan uttrycka någon gen för grundläggande eller kliniska försök, och som en pseudo-skrivit lentivirus har tillgång till de flesta celltyper och vävnader.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbetet stöddes delvis av Public Health Service bevilja 1R01AI081568 från NIAID till YW och genom generösa donationer från donatorer och ryttare i 2009 NYCDC aids Ride organiseras av M. Rosen och Dag2 Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | |||
| 37°C 5%CO2 incubator | |||
| Flow cytometer | FACSCalibur | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allega®6KR | |
| 4°C regrigerator | |||
| -20°C refrigerator | |||
| -80°C refrigerator | |||
| Cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer® AutoT4 | |
| HEK293T cell line | National Institutes of Health | ||
| CEM-SS cell line | National Institutes of Health | ||
| Jurkat cell line J1.1 | National Institutes of Health | ||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | |
| HIV-1NL4-3 | prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA | ||
| pNL-GFP-RRE | copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3 | ||
| pNL-GFP-RRE-SA | Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE | ||
| pCMVΔ8.2 | provided by Dr. Dider Trono | ||
| pHCMV-G | |||
| 10 x HBS (Hepes Buffered Saline) | Invitrogen | 11344-041 | |
| 2M CaCl2 buffer | Invitrogen | S-013-154-10 | |
| 1% paraformaldehy | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Bleach | |||
| 50ml Falcon tubes | BD Biosciences | 358206 | |
| 5ml round bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 0.45μM Millipore filter | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 0.20μM Millipore filter | EMD Millipore | SLFG85000 | |
| 100mm Petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430588 | |
| Size-exclusion column (100,000MW cut off) | Sartorius AG | VS2041 | |
| 2ml frozen tube | Axygen Scientific | SCT-200 | |
| 96-well plate | BD Biosciences | 353227 | |
| 1.7mL Microcentrifuge Tube | Axygen Scientific | MCT- 175-C |
References
- Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus. EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).
- Merzouki, A. HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).
- Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects. AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).
- Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent lentiviral expression vector. Retrovirology. 4, 12-12 (2007).
- Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent indicator T cell line. Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).
- Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis. Retrovirology. 5, 36-36 (2008).
- Perez, V. L. An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation. Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
