Summary
في هذا الفيديو ، Nijole Jasinskiene يوضح المنهجية المستخدمة لتوليد البعوض المعدلة وراثيا الزاعجة المصرية ، والتي هي نواقل حمى الضنك. وأظهرت أساليب إعداد صحيح microinjection الإبر ، dessicating الأجنة ، وأداء microinjection.
Abstract
في هذا الفيديو ، Nijole Jasinskiene يوضح المنهجية المستخدمة لتوليد البعوض المعدلة وراثيا الزاعجة المصرية ، والتي هي نواقل حمى الضنك. وأظهرت أساليب إعداد صحيح microinjection الإبر ، dessicating الأجنة ، وأداء microinjection.
Protocol
إعداد مقدما من microinjection
- البعوض الدم : للحقن من الاثنين الى الجمعة من الإناث إطعام في يوم الخميس الماضي.
- تعد الإبر الزجاج باستخدام برنامج 3 أو 2 (انظر المواد).
- مد أنبوب لأجنة ذبابة الفاكهة هو قارورة الثقافة. الرطب القطن والصوف في الجزء السفلي ، مع قرص من الورق الرطب تصفية تغطية هذه الأزمة.
- إعداد زلة تغطية البلاستيك عن طريق الالتزام المزدوج الجانب الشريط إلى نهاية واحدة. الشريط تقليم لتغطية زلة بحيث تنتهي عند حافة الانزلاق الغطاء.
- يعد النفط مقابل تجفيف (انظر المواد)
- 150 مل دورق البلاستيك مع القطن والصوف الرطب في الجزء السفلي ، مع تغطية قرص من الورق الرطب تصفية (80mm Whatman) للحفاظ على الأجنة بعد الحقن.
إعداد زرع القسري
- جمع 60-10 الإناث تغذية الدم مع استخدام لالشافطة ونقلها إلى القارورة الثقافة ذبابة الفاكهة مع القطن الرطب ورقة الترشيح.
- وضع البعوض العودة الى ظروف insectory في الظلام ، والسماح لتضع بيضها و1H 15min.
- اسمحوا البالغين تطير في القفص ، وإزالة القرص رقة الترشيح مع الأجنة.
- ليصطف والبيض ، وذلك بموجب نطاق تشريح. باستخدام الملقط غرامة رقم 5 أو الفرشاة الجميلة ، واختيار اللون الرمادي لdarkish الرمادي الأجنة وترتيبها في خط على مربع من الورق Whatman 3MM المنقوع بالماء. يجب أن تكون جميع الأجنة في الاتجاه نفسه ، وكما يجب أن يكون الحقن في القطب الخلفي. نهاية الأمامي من الجنين هو أوسع قليلا من الخلفية. الجافة ورقة الترشيح مع الأجنة عن طريق الضغط على ورق الترشيح جافة لأنها (أشياء الرطب ولن تلتزم الشريط). لنقل البيض ، وعكس الشريحة التي تحتوي على الشريط على الوجهين ، ثم اضغط بلطف ضد البيض. نهاية الخلفي من البيض يجب أن تكون قريبة جدا من حافة الشريط جانب ومزدوجة.
- تجفيف الأجنة حوالي 1 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة. أنها بداية لرصعة قليلا لأنها جافة.
- تغطي الأجنة المجفف مع النفط لمنع جفاف الهالوكربون أخرى.
Microinjection للأجنة
- وأهم جانب من جوانب جيدة الحقن هي نوعية الإبرة (انظر المواد).
- شغل الإبرة مع الحل القائم على الحمض النووي ليتم حقنها باستخدام microloader. مطلوب حل القليل جدا الحقن : 1 الى 2 ميكرولتر.
- الاتصال الإبرة إلى Transjector ، التي تسيطر على الوقت الحقن (مانو) وضغط (600) ، والضغط الخلفي (250). يتم تنفيذ Microinjection باستخدام المجهر مع مرحلة الانتقال (لايكا) في التكبير 10 x و micromanipulator. إذا لزم الأمر ، قد أثار المجهر مرحلة التحضير التي تكون التراص الشرائح المجهر 4-5. ضع الغطاء زلة تحمل أجنة على المرحلة التي أثيرت. حقن الأجنة أفقيا لمنع تمزق من باطنة المشيماء ؛ اختراق ينبغي أن يكون في القطب الخلفي. عن طريق الحقن ، وأظل الإبرة ثابتة وتحريك مرحلة من مراحل المجهر.
- حقن 0،2-0،5 NL الحل الموافق حوالي 1-5 ٪ من حجم الجنين. السيطرة على حجم الحقن عن طريق ضبط ضغط الحقن والوقت. ينبغي أن انحنى قليلا ، والأجنة المجفف في أعقاب استعادة مظهر متورم الحقن.
- اختيار الأجنة من زلة تغطية باستخدام الملقط الغرامة أو فرشاة غرامة ، ووضعها في كوب من البلاستيك مع القطن الرطب ورقة الترشيح الرطب. تغطي الدورق مع المناديل الورقية. تبقي في مكان مع شريط مطاطي حول الحافة والعودة إلى الظروف insectary لمدة 4 أيام.
بعد الحقن
- بعد أربعة أيام ، ورقة الجنين بدقة مكان ، جنين ، الجانب السلبي ، على الماء في علبة بلاستيكية كبيرة مع كمية صغيرة من الطعام. أجنة يفقس على مدى فترة طويلة جدا : لا تخلص من ثقافة على الأقل حتى 4-5 أسابيع بعد الحقن.
تلاحظ
الحمض النووي للحقن
تم عزل الحمض النووي البلازميد حل للحقن باستخدام طقم البلازميد EndoFree. وعجلت بناء مزيج مساعد البلازميد معا في تركيز الحق ، مع izopropanol. وكان بيليه تغسل مع الايثانول 70 ٪ قبل إعادة التعليق في المخزن الحقن. قبل الحقن ، باستخدام الحمض النووي نظيفة Millex GV - العمود.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Injection solution | Buffer | 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8 | ||
| Construct plasmid | DNA | 0.5 mg/ml. | ||
| Helper plasmid | DNA | 0.3 mg/ml | ||
| EndoFree Plasmid kit | Kit | Qiagen | ||
| Millex-GV column | SLGV RO4 NL | To clean DNA. | ||
| Glass puller | Instrument | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50 |
| Quartz puller | Instrument | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| Injection glass needles | Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument). | |||
| Aedes aegypti | Animal | Male and female mosquitos, to obtain embryos. | ||
| Drosophila culture vial | For mosquito egg-laying. | |||
| Halocarbon oil | Reagent | Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1) | ||
| Forceps No5 | Tool | |||
| Fine paintbrush | Kolinsky Sable | No. 0000 | ||
| Whatman paper | Tool | |||
| Microloader | Tool | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Transjector | Tool | Eppendorf | ||
| Microscope | Leica Microsystems | With moving stage and micromanipulator. | ||
| 3MM Whatman paper | ||||
| double sided tape |
