Summary
유전자가 뎅그열 바이러스에 대한 잠재적 내화물로 식별되면, 그것은 모기 내에서 바이러스 감염을 방지에의 역할에 대해 평가해야합니다. 이 프로토콜은 모기의 뎅그열 감염의 범위가 assayed 수있는 방법을 보여줍니다. 문화, 멤브레인 수유 모기 인간의 혈액에있는 바이러스를 성장하고, 모기 midgut에서 바이러스 titers을 시금에 대한 기술은 증명됩니다.
Abstract
이 절차의 목적은 실험실 조건에서 뎅그열 바이러스 Aedes의 모기를 감염하고 모기가 조직의 감염 수준 및 바이러스의 역학을 조사하는 것입니다. 이 프로토콜은 정기적으로, 특히 벡터 능력을 확인할 수있는 새로운 호스트 요인의 식별, 모기 바이러스 상호 작용을 연구하는 데 사용됩니다. 전체 실험은 BSL2의 연구실에서 수행되어야합니다. Plasmodium falciparum 감염과 마찬가지로, 장갑과 실험 복을 포함한 적절한 복장은 항상 착용해야합니다. 실험 후, 바이러스와 접촉 온 모든 자료는 일반 세탁기와 함께 진행하기 전에 75 % 에탄올과 표백로 치료해야합니다. 다른 모든 자료는 폐기 앞에 autoclaved해야합니다.
Protocol
A.이 C6/36 세포주에 바이러스를 전파.
- 세포는 75cm이 플라스크에 confluency 80 % 성장;
- 술병에 남아 3-4 ML과 미디어를 제거;
- 0.5 ML 주식 바이러스를 가지고 세포 당 1.5 바이러스 입자의 감염의 다중성과 함께 위의 셀에 추가합니다. 서서히 실온에서 15 분 동안 휴대용 술병을 흔들어.
- 5% CO 2와 37 ° C에서 45 분 동안 품어
- 30 ML 미디어를 추가, 5 일 동안 알을 품다.
B. 바이러스와 혈액의 혼합물 준비
- 스크레이퍼로 세포를 분리하고 50 ML 원뿔 튜브에 세포와 미디어를 전송;
- 10 분 800g에 Centrifugate, 표면에 뜨는를 수집하지만, 세포 펠렛과 함께 뜨는의 1ml를 떠나;
- ° C 물 목욕, 반복 2 ~ 3 배 37 해동 후 건조 CO 2에 위의 세포 펠렛을 고정하고,
- 뜨는을하고, 3 단계에서 수집한 뜨는와 결합, 10 분 800g에 Centrifugate;
- Plasmodium falciparum과 아노 펠 레스 모기를 감염시킬 수 gametocyte 문화의 준비에 대해 동일한 절차 (3 단계)와 전체 인간의 혈액을 수집;
- 4 단계에서 바이러스 뜨는와 함께 위의 모든 인간의 혈액의 동일한 금액을 결합, 그리고 (전체 볼륨의 10 %) 인간의 혈청을 추가합니다.
- 37 ° C 물 목욕 30 분 인간의 혈액과 뎅그열 바이러스의 상기 혼합물을 품어
C. 먹이 모기
이 절차는 모기에 Plasmodium falciparum 감염에 대한 섹션에서 설명했던 일들을 거의 동일합니다. 우리는 일 7시 분석 midgut 감염, 피로 수유 후 14 일에서 타액 감염. 바이러스와 접촉에 온 모든 자료는 75 % 에탄올과 10 %의 다음 표백제 처음에 처리됩니다.
D. 어세 모기 조직에서 바이러스 titer
- 2-3 일 모기 조직의 절개 전에 세포는 분석이 실시되는 하루 confluency 80 %에 도달 이러한 24 잘 접시에 C6/36 세포를 성장;
- 모기가 4 anesthetized 아르 ° C, 희생과 1 분 75 % 에탄올에서 그들을 담글하여 멸균 표면. 그렇다면 모기는 해부 현미경 midgut 또는 침샘의 해부 전에 두 번 멸균 물로 씻어되었습니다. 이 단계에서 아래의 모든 절차는 생물 학적 안전 캐비닛 같은 무균 환경에서 실시해야합니다. 이러한 조직은 150 μl 미디어를 포함하는 튜브에 옮겨 90 초간 Kontes 펠렛 유봉 모터 균질되며
- 990 μl 미디어에 homogenate 10 μl를 추가하여 1:100 희석하다;
- 추가 1 확인 : 10, 1:100 및 96 잘 판에 매체와 1:1000 희석을;
- 24 잘 판에있는 미디어를 제거하고 각 해당 잘하려면 위의 네 dilutions 각각 100 μl를 추가합니다;
- 그리고 5 %에서 45 분 동안 부화 상온에서 15 분에 대해 천천히 접시를 흔들어 CO 2 37 ° C;
- 각 잘하는 프로필 메틸 셀룰로오스 오버레이 (1 %)의 1ml을 추가합니다;
- 37 접시를 품어 ° C 오일에 대한 5 % CO 2;
- 여기에서 단계 멸균 환경을 필요로하지 않지만 같은 다른 병원체주의는 항상 주의해야한다. 각 플레이트의 프로필 메틸 셀룰로오스 오버레이를 취소하고 여분 미디어를 제거 얼룩
- 각 잘하는 메탄올 / 아세톤 정착액 (1:1)의 1ml을 추가합니다. 1 시간 4 ° C에 보관;
- 정착액을 붓고하고, 1X PBS로 한번 씻어;
- 5% 곤드레 만 드레 취한와 바이러스에 대한 기본 항체에 1:1000 희석하다;
- 1 시간 각 37 품어, 잘 ° C로 희석 hyperimmune 액체 200 μl를 추가합니다;
- 1 X PBS로 hyperimmune 유체 및 세척 플레이트를 제거합니다
- 5% 곤드레 만 드레 취한 (1 X PBS의 100 ML에 5g 분말 탈지 우유)에 염소 안티 마우스 공액의 1:1000 희석 (KPL 캣 # 074-1806)를 준비하고, 다음 각 잘 200 μl을 추가하고에서 알을 품다 1 시간을위한 37 ° C;
- 다음과 같이 기판을 준비 : 해산 후, 1 X PBS의 20 ML에 3' - Diaminobenzidine terrahydrochloride 1 타블렛 (시그마 고양이 # D5905)을 추가하고 다음 30 % 수소 퍼옥시데이즈 8 μl를 추가
- 각 잘하려면 위의 기판 200 μl를 추가합니다. 10 분 실온에서 서합시다
- 기판을 제거하고 각 잘하는 증류수의 1ml을 추가하여 반응을 정지
- 건조에 물 얼룩 접시를 부어
- 바이러스 입자를 카운트
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Incubator | with 5% CO2, 37oC | |||
50 ml conical tubes | plastic | |||
human serum and blood | O+ | |||
pipette tip | for tissue culture | |||
pipettman | ||||
Pasteur pipetts | glass, sterile | |||
water bath | 37C | |||
centrifuge | ||||
parafilm | ||||
circulating water bath | ||||
glass membrane feeders | with rubber tubing to fit feeders | |||
mosquito cups | ||||
75% ethanol | ||||
10% bleach | ||||
Tissue-culture plates | 6-well, 24-well and 96-well plates | |||
Petri dish | glass | |||
Slides | ||||
fine-tip forceps | ||||
PBS | 1X, sterile | |||
dissecting microscope | Microscope | |||
C6/36 cells | cells | For virus propagation | ||
C6/36 medium | MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin. | |||
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase | |
30% hydrogen peroxidase | ||||
A. aegypti | Animal | mosquito |