Summary
ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאל הווירוס דנגה, זה חייב להיות מוערך על תפקיד זה במניעת זיהומים נגיפיים בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים דנגה של יתושים יכול להיות assayed. שיטות לגידול את הנגיף בתרבית, האכלה קרום דם יתושים אדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.
Abstract
מטרתו של נוהל זה כדי להדביק את היתוש Aedes עם וירוס דנגה בתנאי מעבדה ולבדוק את רמת זיהום דינמי של הווירוס ברקמות יתושים. פרוטוקול זה נמצא בשימוש שגרתי ללימוד יתושים וירוס אינטראקציות, במיוחד עבור זיהוי של גורמים מארח רומן כי הם מסוגלים לקבוע יכולת וקטור. הניסוי כולו צריך להתבצע במעבדה BSL2. בדומה לזיהומים Plasmodium falciparum, בלבוש הולם, כולל כפפות וחלוק מעבדה חייב להיות משוחק בכל עת. לאחר הניסוי, כל החומרים כי בא במגע עם הנגיף צריכים להיות מטופלים עם 75% אתנול ו מולבן לפני שתמשיך עם כביסה רגילה. כל החומרים האחרים צריכים להיות autoclaved לפני השלכת אותם.
Protocol
א להפיץ את הנגיף בקו C6/36 התא.
- תאים לגדול ל -80% confluency בבקבוק 75 ס"מ 2;
- הסר את התקשורת עם 3-4 מ"ל הנותרים הבקבוק;
- קח 0.5 מניות וירוס מ"ל ולהוסיף לתוך התא מעל עם ריבוי של 1.5 זיהום חלקיקי הנגיף לכל תא. טלטול את הבקבוק במשך 15 דקות לאט בטמפרטורת החדר.
- דגירה במשך 45 דקות ב 5% CO 2 ו - 37 ° C
- הוסף מדיה 30 מ"ל, ו דגירה במשך 5 ימים.
ב הכינו תערובת של הנגיף בדם
- ניתוק התא עם מגרד ולהעביר את תא התקשורת של 50 צינורות חרוטי מ"ל;
- Centrifugate ב 800g במשך 10 דקות, לאסוף את supernatant, אבל להשאיר 1ml של supernatant עם תא גלולה;
- להקפיא את התא גלולה לעיל CO 2 יבש ולאחר מכן להפשיר בתוך 37 ° C אמבט מים, חזרו פעמיים עד שלוש פעמים;
- Centrifugate ב 800g במשך 10 דקות, לקחת את supernatant, ולשלב עם supernatant שנאספו בשלב 3;
- איסוף דם אדם שלם עם הליך זהה (שלב 3) להכנת תרבות gametocyte להדביק יתוש האנופלס עם Plasmodium falciparum;
- מערבבים כמות שווה של דם מעל האנושי כולו עם supernatant הנגיף בשלב 4, ולהוסיף בסרום אדם (10% של נפח כולו).
- דגירה את התערובת מעל דם האדם וירוס דנגה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים
ג יתושים האכלה
הליך זה כמעט זהה מה תוארו בסעיף לטיפול בדלקות Plasmodium falciparum של יתושים. אנו assay את הזיהום midgut ביום 7, ואת זיהום הרוק ביום 14 לאחר האכלה דם. כל החומר בא במגע עם הנגיף מטופלים הראשון עם אתנול 75% ולאחר מכן עם אקונומיקה 10%.
ד Assay כייל הנגיף ברקמות יתושים
- יומיים או שלושה לפני דיסקציה של רקמת יתושים, לגדול C6/36 תא צלחת 24 גם כך התא להגיע 80% confluency על היום שבו assay מתנהל;
- יתושים מורדמים ב 4 ° C, הקריבו פני השטח סטרילי ידי טבילתם אתנול 75% למשך דקה 1. אז יתושים נשטפו עם מים סטריליים פעמיים לפני דיסקציה של בלוטת הרוק midgut או מתחת למיקרוסקופ לנתח. מ בשלב זה, את כל ההליך בהמשך צריך להתנהל בסביבה סטרילית כגון ארון בטיחות ביולוגית. רקמות אלו מועברים צינור המכיל 150 μl התקשורת, ומעורים עם גלולה Kontes העלי מנוע עבור 90 שניות;
- ביצוע דילול 1:100 ידי הוספת 10 μl של homogenate לתוך 990 μl התקשורת;
- בצע עוד 1: 10, 1:100 ו 1:1000 דילול עם המדיום בצלחת 96 היטב;
- הסר את המדיה צלחת 24 היטב, ולהוסיף 100 μl של כל אחד מארבעת דילולים לעיל גם בכל המקביל;
- לנער את הצלחת לאט במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ואז דגירה של 5% במשך 45 דקות CO 2 ו - 37 ° C;
- הוסף 1ml של methycellulose כיסוי (1%) זה טוב;
- דגירה צלחות ב 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 5 ימים;
- השלבים מכאן והלאה לא דורשים סביבה סטרילית אך כמו כל טיפול אחר הפתוגן צריך להילקח בכל עת. מחק כיסוי methycellulose מהצלחת כל כתם כדי להסיר עודפי התקשורת
- הוסף 1ml של מקבע מתנול / אצטון (1:1) היטב כל אחד. שמור על 4 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה;
- יוצקים את מקבע, ולשטוף פעם עם 1X PBS;
- בצע 1:1000 דילול כדי הנוגדן העיקרי נגד הנגיף עם שיכור סחוט 5%;
- הוסף 200 μl של נוזל hyperimmune בדילול זה גם C, דגירה על 37 מעלות במשך שעה 1;
- הסרת נוזל hyperimmune צלחת לשטוף עם 1 X PBS
- הכן דילול של 1:1000 המצומד עז אנטי עכבר (חתול KPL # 074-1806) ב 5% שיכור סחוט (5 גרם חלב דל שומן אבקת ב 100 מ"ל של 1 X PBS), ולאחר מכן להוסיף 200 μl זה היטב, דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1;
- הכנת המצע כדלקמן: להוסיף 1 טבלית של terrahydrochloride 3'-Diaminobenzidine (חתול Sigma # D5905) בתוך 20 מ"ל של 1 X PBS, לאחר מומס, ולאחר מכן להוסיף 8 μl של peroxidase מימן 30%
- הוסף 200 μl של המצע הנ"ל גם כל אחד. בואו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות
- הסר המצע ולהפסיק התגובה על ידי הוספת 1ml של מים מזוקקים זה טוב
- יוצקים מעל צלחות מים כתם להתייבש
- ספירת החלקיקים וירוס
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | with 5% CO2, 37oC | |||
| 50 ml conical tubes | plastic | |||
| human serum and blood | O+ | |||
| pipette tip | for tissue culture | |||
| pipettman | ||||
| Pasteur pipetts | glass, sterile | |||
| water bath | 37C | |||
| centrifuge | ||||
| parafilm | ||||
| circulating water bath | ||||
| glass membrane feeders | with rubber tubing to fit feeders | |||
| mosquito cups | ||||
| 75% ethanol | ||||
| 10% bleach | ||||
| Tissue-culture plates | 6-well, 24-well and 96-well plates | |||
| Petri dish | glass | |||
| Slides | ||||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | 1X, sterile | |||
| dissecting microscope | Microscope | |||
| C6/36 cells | cells | For virus propagation | ||
| C6/36 medium | MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin. | |||
| 3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase | |
| 30% hydrogen peroxidase | ||||
| A. aegypti | Animal | mosquito |
