Summary
حالما يتم التعرف على الجينات المقاومة للحرارة كما يحتمل أن تكون للفيروس حمى الضنك ، لا بد من تقييمها لدورها في الوقاية من العدوى الفيروسية داخل البعوض. هذا البروتوكول يوضح كيف يمكن أن يعاير مدى الإصابات بحمى الضنك من البعوض. وأظهرت تقنيات لزراعة الفيروس حتى في الثقافة والدم غشاء البعوض تغذية الإنسان ، ويعاير التتر الفيروسية في المعي المتوسط البعوض.
Abstract
الغرض من هذا الاجراء هو لإصابة البعوضة الزاعجة مع فيروس حمى الضنك في حالة المختبرات وفحص مستوى العدوى وديناميكية من الفيروس في أنسجة البعوض. ويستخدم هذا البروتوكول بشكل روتيني لدراسة التفاعلات البعوض الفيروس ، وخاصة لتحديد العوامل المضيفة الرواية التي تكون قادرة على تحديد اختصاص النواقل. يجب أن تجرى التجربة في مختبر كامل BSL2. مماثلة للعدوى الملاريا المنجلية ، يجب أن تلبس الملابس المناسبة بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر في جميع الأوقات. بعد التجربة ، وجميع المواد التي جاءت في اتصال مع الفيروس يجب أن يتم التعامل مع 75 ٪ من الإيثانول والمقشور قبل الشروع في غسل طبيعية. جميع المواد الأخرى يجب أن يتم تعقيمها قبل التخلص منها.
Protocol
A. نشر الفيروس في خط خلية C6/36.
- الخلايا تنمو إلى 80 ٪ في 75 قارورة confluency 2 سم ؛
- إزالة وسائل الاعلام مع مل 3-4 المتبقية في قارورة ؛
- تأخذ 0.5 مل الفيروس الأسهم وإضافة إلى الخلية المذكورة أعلاه مع تعدد العدوى من جزيئات الفيروس بنسبة 1.5 في الخلية. هز القارورة ببطء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان لمدة 45 دقيقة في 5 ٪ CO 2 و 37 درجة مئوية
- إضافة الوسائط 30 مل ، واحتضان لمدة 5 أيام.
باء تحضير خليط من الفيروسات والدم
- فصل الخلية مع مكشطة ونقل الخلايا وسائل الإعلام للأنابيب مخروطية 50 مل ؛
- نباذة في 800G لمدة 10 دقيقة ، جمع طاف ، ولكن ترك 1ml من طاف مع بيليه الخلية ؛
- تجميد أعلاه بيليه في الخلية الجافة CO 2 ثم الذوبان في الماء 37 درجة مئوية حمام ، كرر مرتين إلى ثلاث مرات ؛
- نباذة في 800G لمدة 10 دقيقة ، واتخاذ طاف ، ويتحد مع طاف جمعها من الخطوة 3 ؛
- جمع الدم البشري كله مع نفس الإجراء (الخطوة 3) لإعداد ثقافة العرسية تصيب الأنوفيلة البعوض مع المنجلية ؛
- الجمع بين كمية متساوية من الدم البشري كله أعلاه طاف مع الفيروس من الخطوة 4 ، وإضافة مصل الإنسان (10 ٪ من حجم كاملة).
- احتضان الخليط أعلاه من الدم البشري وفيروس حمى الضنك لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 37 ° C
جيم تغذية البعوض
هذا الإجراء هو مطابق تقريبا الى ما تم وصفها في المقطع للعدوى الملاريا المنجلية في البعوض. نحن مقايسة العدوى المعى المتوسط في يوم 7 وإصابة اللعابية في اليوم 14 بعد تغذية الدم. يتم التعامل مع جميع المواد التي جاءت في اتصال مع أول فيروس الايثانول مع 75 ٪ ثم 10 ٪ مع التبييض.
د. عيار الفحص للفيروس في الأنسجة البعوض
- يومين أو ثلاثة أيام قبل تشريح الأنسجة البعوض ، وتنمو C6/36 خلية في 24 لوحة جيدا ان هذه الخلية إلى 80 ٪ في اليوم confluency عندما أجرى الفحص ؛
- البعوض هي تخدير عند 4 درجات مئوية ، وظهرت التضحية العقيمة التي نقع عليها في الايثانول 75 ٪ لمدة 1 دقيقة. ثم تم غسلها بالماء المعقم البعوض مرتين قبل تشريح الغدة اللعابية المعي المتوسط أو تشريح تحت المجهر. من هذه الخطوة ، كل الإجراء أدناه يجب أن تتم في بيئة معقمة مثل خزانة السلامة البيولوجية. يتم نقل هذه الأنسجة التي تحتوي على أنبوب 150 ميكرولتر وسائل الاعلام والمتجانس مع محرك Kontes مدقة بيليه لمدة 90 ثانية ؛
- جعل التخفيف 1:100 بإضافة 10 ميكرولتر من جناسة في وسائل الاعلام ميكرولتر 990 ؛
- كذلك جعل 1 : 10 ، 1:100 و 1:1000 التخفيف مع المتوسط في 96 لوحة جيدا ؛
- إزالة وسائل الإعلام في لوحة 24 أيضا ، وإضافة 100 ميكرولتر من كل من التخفيفات الأربعة المذكورة أعلاه على كل جانب المقابلة ؛
- هزة لوحة ببطء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتضان لمدة 45 دقيقة في 5 ٪ CO 2 و 37 درجة مئوية ؛
- إضافة 1ml من تراكب methycellulose (1 ٪) على كل جانب ؛
- احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5 ٪ لمدة 5 أيام ؛
- الخطوات من هنا لا تتطلب بيئة معقمة ولكن ينبغي أن تؤخذ كما هو الحال مع أي رعاية الممرضة الأخرى في جميع الأوقات. تجاهل تراكب methycellulose من كل لوحة وصمة عار لازالة الزائدة وسائل الإعلام
- إضافة 1ml من الميثانول / الأسيتون تثبيتي (1:1) على كل بئر. تبقي على 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة ؛
- تخلصي من تثبيتي ، ويغسل مرة واحدة مع 1X PBS ؛
- جعل 1:1000 التخفيف إلى الأجسام المضادة ضد الفيروس الأولية مع blotto 5 ٪ ؛
- إضافة 200 ميكرولتر من السائل المخفف لكل مفرط المناعة C جيدا ، واحتضان على 37 درجة لمدة 1 ساعة ؛
- إزالة السوائل ومفرط المناعة وحة يغسل مع PBS X 1
- يعد التخفيف من 1:1000 المتقارن المضادة للماوس الماعز (القط KPL # 074-1806) في 5 ٪ blotto (اللبن المجفف المنزوع 5G في 100 مل من برنامج تلفزيوني X 1) ، ثم قم بإضافة 200 ميكروليتر إلى كل بئر ، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ؛
- تعد الركيزة على النحو التالي : 1 إضافة قرص من 3' - Diaminobenzidine terrahydrochloride (سيغما القط # D5905) في 20 مل من برنامج تلفزيوني X 1 ، بعد حلها ، ومن ثم إضافة 8 ميكرولتر من البيروكسيداز الهيدروجين 30 ٪
- إضافة 200 ميكرولتر من الركيزة أعلاه إلى كل بئر. دعونا نقف عند درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة
- إزالة الركيزة ووقف رد الفعل بإضافة 1ml من الماء المقطر إلى كل بئر
- صب قبالة المياه وصمة عار لوحات لتجف
- عد جسيمات الفيروس
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | with 5% CO2, 37oC | |||
| 50 ml conical tubes | plastic | |||
| human serum and blood | O+ | |||
| pipette tip | for tissue culture | |||
| pipettman | ||||
| Pasteur pipetts | glass, sterile | |||
| water bath | 37C | |||
| centrifuge | ||||
| parafilm | ||||
| circulating water bath | ||||
| glass membrane feeders | with rubber tubing to fit feeders | |||
| mosquito cups | ||||
| 75% ethanol | ||||
| 10% bleach | ||||
| Tissue-culture plates | 6-well, 24-well and 96-well plates | |||
| Petri dish | glass | |||
| Slides | ||||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | 1X, sterile | |||
| dissecting microscope | Microscope | |||
| C6/36 cells | cells | For virus propagation | ||
| C6/36 medium | MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin. | |||
| 3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase | |
| 30% hydrogen peroxidase | ||||
| A. aegypti | Animal | mosquito |
