Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Application Notes

CryoStor الحفظ بالتبريد البروتوكول

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

Sign in to register to receive emails with product information.

Summary

وتستخدم حلول CryoStor الحفظ بالتبريد لإعداد والحفاظ على الخلايا المتطرفة في بيئات درجات الحرارة المنخفضة ، من دون الحاجة لمصل الدم ، والبروتينات ، أو على مستويات عالية من العوامل السامة للخلايا.

Abstract

فعالية الحفظ بالتبريد -- والتي تتضمن مرحلة ما بعد ذوبان الجليد الانتعاش ، وقدرتها على البقاء ، وظائف ذات أهمية لكل من البحوث والتطبيقات السريرية. الضغوط المتراكمة التي تنتج من عملية الحفظ بالتبريد والتجميد وسائل الإعلام نتيجة الأمثل في موت الخلية من نخر وموت الخلايا المبرمج ، ويمكن إعداد 1-5 خلايا والأنسجة وحفظها في درجة حرارة منخفضة جدا البيئات (-80 درجة مئوية إلى -196 درجة مئوية) باستخدام CryoStor الحفظ بالتبريد الحلول. منذ تصاغ هذه الحلول لمعالجة الجوانب البيولوجية الجزيئية للخلايا أثناء عملية الحفظ بالتبريد ، فإنها تقلل من مستوى الحفظ بالتبريد التي يسببها موت الخلايا تأخر الحدوث ، وبالتالي تحسين قابلية الذوبان في مرحلة ما بعد الخلية ووظيفتها. بالإضافة إلى ذلك ، أنها تحتاج إلى تضمين مصل ، والبروتينات ، أو على مستويات عالية من العوامل السامة للخلايا هو القضاء مع هذا البروتوكول. في هذه المقالة الفيديو ، وسوف نظهر لإجراءات التجميد والتخزين ، وذوبان للخلايا ، وكذلك تقييم جدوى من الخلايا بعد ذوبان الجليد.

Protocol

1. التحضير لخلايا الحفظ بالتبريد

  1. للتحضير لخلايا مكان الحفظ بالتبريد ، إلى التعليق من التفكك أو ميكانيكية الأنزيمية.
  2. المقبل ، الطرد المركزي للحصول على خلايا بيليه الخلية.
  3. بعد الطرد المركزي ، وإزالة أكبر قدر من وسائل الإعلام الثقافة طاف وقت ممكن ، للحد من تمييع الحل CryoStor ، والتي سيتم إضافتها في الخطوة التالية.
  4. قبل فتح زجاجة من محلول CryoStor الباردة ، ويمسح أسفل خارج الحاوية مع الايثانول 70 ٪.
  5. العزل : إضافة CryoStor الباردة للحصول على خلية من تركيزات 0،5-10 × 10 6 خلية / مل.
  6. PRE - FREEZE : احتضان تعليق في الخلية 2-8 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا.

2. تجميد وتخزين خلايا

  1. نظم لتجميد الخلايا معظم الثدييات ، واستخدام معيار معدل بطيء للرقابة بروتوكول مع جهاز تبريد تجميد أو حاوية الأيزوبروبانول قبل تبريده الى 2-8 درجة مئوية.
  2. التنوي : تجميد العينات في -80 درجة مئوية.
  3. بعد حوالي 10 دقيقة. في -80 درجة مئوية ، والشروع في التنوي الجليد ضمن العينة (البذر) في -5 درجة مئوية تقريبا باستخدام النيتروجين السائل انفجار برنامج الإعداد على الفريزر معدل رقابة أو الانفعالات الميكانيكية (نفض الغبار أو الاستفادة) من الحاوية cryovial / العينة.
  4. تجميد الخلايا لساعات 3-4 (للحاوية الأيزوبروبانول).
  5. التخزين : لتخزين طويل الأجل ، والعينات في درجة حرارة المكان النيتروجين السائل ، وأدناه -130 درجة مئوية. تخزين العينات في -80 درجة مئوية هو الوحيد الموصى به لفترة قصيرة تخزين أسابيع أو أشهر.

3. ذوبان خلايا

  1. يجب إذابة العينات المجمدة بسرعة في حمام ماء C ° 37. بلطف دوامة قد ذاب العينة (ق) حتى كل الجليد مرئية. الوقت التقريبي للذوبان عينة مل 1 في cryovial ما يقرب من 3 دقائق.
  2. لا تسمح للعينة (s) إلى درجات حرارة دافئة فوق المبردة (00-10 درجة مئوية). متى يجب إزالتها من حمام المياه ، وcryovial (ق) تكون باردة لمسة.
  3. تمييع خليط الخلية / CryoStor على الفور مع وسائل الإعلام أن الثقافة هي ما بين 20 درجة مئوية و 37 درجة مئوية ، وذلك باستخدام نسبة تخفيف 1:10 أو أكبر من العينة إلى وسائل الإعلام.
  4. لوحة الخلايا في التكوين المناسب.
  5. مكان الخلايا في ظروف ثقافة أو استخدام على الفور.
  6. اربع وعشرين ساعة بعد ذوبان الجليد ، وتقييم الخلايا للبقاء.

4. ممثل النتائج

  1. وتعتبر نتائج التقييم بقاء الخلية على مدار 24 ساعة تحسن آخر في الشكل 1. مقارنة النتائج مع إذابة الخلايا غير المجمدة الضوابط.

الشكل 1
الشكل 1. وكانت الخلايا الليفية الجلد الطبيعي cryopreserved الإنسان (NHDF) في وسائل الإعلام الثقافة / مصل / DMSO أو في وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد CryoStor : انتعاش الليفية الإنسان بعد الحفظ بالتبريد في وسائل الإعلام الثقافة التقليدية / مصل / DMSO أو مصل خالية من البروتين وخالية من الخلايا مثل CryoStor. بعد ذوبان الجليد ، وسمح لاسترداد الخلايا في ظروف ثقافة القياسية (37 درجة مئوية / 5 ٪ CO 2 / الرطبة الهواء) في وسائل الإعلام نمو الخلايا الليفية. ويعاير الخلايا في 24 ساعة بعد تحسن العلاقات مع alamarBlue لتقييم جدوى مناسب الخلية التالية مظهر من مظاهر تأخر بدء عمليات موت الخلايا المبرمج ومثل نخر الثانوية.

Discussion

أثبتت فعالية هذا الفيديو الحفظ بالتبريد من الخلايا حلا مثل الحفظ بالتبريد المصل حرة وخالية من البروتين مقارنة لcryococktail التقليدية المصنوعة من متوسط ​​الثقافة ، ومصل ، وDMSO. وكيفية cryopreserve الخلايا ، أوجز فوائد استخدام حلا الحفظ بالتبريد مثل الخلايا ، ومثالا لكيفية تقييم الجدوى الحقيقية من الخلايا بعد ذوبان الجليد. ومن المهم أن نلاحظ أن يموت لأن الخلايا المبرمج ونخر بعد ذوبان الجليد على مدى فترة من ساعات إلى أيام ، ما لوحظ قابلية الذوبان كما يراها الوظائف فورا قد لا يكون صحيح الاستمرارية على المدى الطويل. وهذا يمكن أن الخلية تأخر الموت أثر لاحقا على نوعية engraftment الخلية والانتعاش الفعال للقدرات الفنية الخليوي ، وكلاهما حاسما لنجاح السريرية والعلاجات خلية الأنسجة.

Disclosures

يعمل ابى ماثيو Biolife حلول ، وشركة التي تنتج كاشف المستخدمة في هذه المقالة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
CryoStor الحفظ بالتبريد البروتوكول
Play Video

Cite this Article

Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter