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CryoStor冻存协议

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

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Summary

CryoStor冷冻保存的解决方案是用于准备和保存在超低温环境中的细胞,无血清,蛋白质或细胞毒性药物的高层次的需要。

Abstract

超低温冷冻保存的疗效 - 其中包括解冻后复苏,活力和功能研究和临床应用的重要性。准备1-5个细胞和组织,从冷冻保存过程和次优冻结媒体在细胞坏死和凋亡的死亡的结果的结果。,并保存在超低温环境(-80℃-196℃)使用的累积强调CryoStor冷冻保存的解决方案。由于这些解决方案的制定,以解决在冷冻保存过程中的细胞分子生物学方面,他们减少冻存引起的迟发性细胞死亡的水平,从而改善解冻后的细胞活力和功能。此外,他们还需要包括血清,蛋白质或细胞毒性药物的高的水平,是与本议定书​​淘汰。在这个视频文章中,我们将演示冻结,存储,和解冻的细胞,以及细胞解冻后的可行性评估的程序。

Protocol

1。准备冻存细胞

  1. 为了准备冻存细胞,到悬挂,机械或酶解。
  2. 接下来,离心机细胞获得细胞沉淀。
  3. 离心后,去除培养基上清液尽可能减少CryoStor解决方案,将在下一步添加稀释。
  4. 打开一瓶冷CryoStor解决方案之前,用70%乙醇擦拭容器外。
  5. 隔离:加冷CryoStor获得0.5-10 × 10 6细胞/ ml的细胞浓度。
  6. 预冻:孵育细胞悬液,在2-8℃,约10分钟。

2。冻结和存储单元

  1. 要冻结大多数哺乳动物细胞系统,使用标准的速度缓慢控制冷却协议的冷冻设备或异丙醇集装箱预冷至2-8 ° C。
  2. 成核:冷冻样品在-80 ° C
  3. 大约10分钟后。于-80 ° C,启动内冰核样本(播种)在约-5℃使用液氮爆裂程序设置在控制速率冷冻或离心管/样品容器的机械搅拌(轻弹或自来水)。
  4. 冻结3-4小时的细胞(异丙醇容器)。
  5. 存储:对于长期储存,将样品在液氮温度低于-130 ° C。样品存放在-80 ° C是周的短期存储建议个月。

3。解冻细胞

  1. 冷冻样品应在37℃水浴快速解冻。轻轻的漩涡,直到所有的可见冰的样本(S)已经融化。大约在一个离心管1 mL样品解冻时间约3分钟。
  2. 切勿使样品(S)冷冻温度(0-10℃)以上的温暖。水浴,离心管(S)中删除时,应冷静地触摸。
  3. 立即稀释的细胞/ CryoStor混合培养基,20 ° C和37 ° C之间,使用的1:10的比例稀释或媒体更大的样本。
  4. 板细胞在适当的配置。
  5. 立即到文化条件或位置细胞利用。
  6. 二十四个小时解冻后,评估可行性的细胞。

4。代表性的成果

  1. 24小时后解冻的细胞活力评估的结果如图1所示。与非冷冻控制解冻细胞的比较结果。

图1
图1。以下冷冻保存传统文化传媒/血清/ DMSO或无血清和无蛋白的胞状CryoStor的人成纤维细胞的恢复正常的人类皮肤成纤维细胞(NHDF)文化传媒/血清/ DMSO或 CryoStor冻存媒体冻存。解冻后,细胞被允许在标准培养条件下(37 ° C / 5%的CO 2 /潮湿的空气)中的成纤维细胞生长介质中恢复。在解冻后24小时细胞检测与alamarBlue迟发性细胞死亡过程,如细胞凋亡和继发性坏死的表现,作出适当的评估细胞活力。

Discussion

该视频显示在比较传统cryococktail从培养液,血清和DMSO制成的冷冻保存一个类似细胞内的无血清和无蛋白冷冻保存的解决方案的疗效。如何冻存细胞,细胞内像冷冻保存的解决方案,以及如何评估细胞解冻后的真实可行性例如使用的好处概述。重要的是要注意因为解冻后在一个小时内到数天的细胞凋亡和坏死的细胞死亡,什么是感知的可行性立即解冻后观察未必是真正的生存能力长期。这种迟发性细胞死亡,随后可以影响细胞植入的质量和细胞功能,有效的恢复,这两者都是临床细胞和组织疗法的成败的关键。

Disclosures

阿比瓦尔马修是受雇于电子商务会员系统BioLife解决方案,公司生产在这篇文章中使用的试剂。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

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References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
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Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

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