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Application Notes

CryoStor Cryoconservation Protocole

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

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Summary

CryoStor solutions cryoconservation sont utilisés pour préparer et conserver les cellules dans des environnements ultra basse température, sans la nécessité pour le sérum, les protéines, ou des niveaux élevés d'agents cytotoxiques.

Abstract

Cryoconservation d'efficacité - qui comprend la récupération post-dégel, la viabilité et la fonctionnalité est d'une importance à la fois à la recherche et les applications cliniques. Le stress cumulatifs qui résultent du processus de cryopréservation et suboptimale geler les médias suite à la mort cellulaire par nécrose et l'apoptose. 1-5 cellules et tissus peuvent être préparés et conservés dans des environnements ultra basse température (-80 ° C à -196 ° C) à l'aide CryoStor solutions cryoconservation. Comme ces solutions sont formulées pour aborder les aspects de biologie moléculaire des cellules pendant le processus de cryoconservation, ils réduisent le niveau de cryoconservation induit la mort cellulaire d'apparition retardée, ce qui améliore la viabilité cellulaire après décongélation et la fonction. En outre, ils ont besoin d'inclure le sérum, les protéines, ou des niveaux élevés d'agents cytotoxiques est éliminée avec ce protocole. Dans cet article, vidéo, nous allons démontrer les procédures de gel, de stockage et décongélation des cellules, ainsi que d'une évaluation de la viabilité des cellules après décongélation.

Protocol

1. Cellules Préparation pour la cryoconservation

  1. Pour se préparer à la cryoconservation des cellules place, en suspension par dissociation mécanique ou enzymatique.
  2. Ensuite, les cellules centrifugeuse pour obtenir un culot cellulaire.
  3. Après centrifugation, enlever autant de milieux de culture surnageant que possible, de réduire la dilution de la solution CryoStor, qui sera ajouté à l'étape suivante.
  4. Avant d'ouvrir la bouteille de solution CryoStor froide, essuyer l'extérieur du conteneur avec de l'éthanol à 70%.
  5. ISOLEMENT: Ajouter CryoStor froide pour obtenir des concentrations cellulaires de 0,5-10 x 10 6 cellules / ml.
  6. PRE-GEL: Incuber la suspension cellulaire à 2-8 ° C pendant environ 10 minutes.

2. La congélation et de stockage des cellules

  1. Pour figer les systèmes cellulaires de mammifères les plus, utiliser un taux standard lente et contrôlée du protocole de refroidissement avec un dispositif de gel ou de l'isopropanol contenant pré-refroidi à 2-8 ° C.
  2. Nucléation: les congeler à -80 ° C.
  3. Après environ 10 min. à -80 ° C, initier la nucléation de la glace dans l'échantillon (ensemencement) à environ -5 ° C en utilisant soit un programme d'azote liquide éclaté paramètre sur un taux de congélation contrôlée ou une agitation mécanique (effleurement ou du robinet) du conteneur cryovial / échantillon.
  4. Congelez les cellules pendant 3-4 heures (pour les conteneurs isopropanol).
  5. ENTREPOSAGE: Pour stockage à long terme, des échantillons à des températures d'azote liquide, au-dessous de -130 ° C. Stockage des échantillons à -80 ° C est recommandée uniquement pour stockage à court terme des semaines voire des mois.

3. Cellules dégel

  1. Les échantillons congelés doivent être décongelés rapidement dans un bain d'eau à 37 ° C. Remuer doucement l'échantillon (s) jusqu'à toute la glace a fondu visibles. Le temps de décongélation approximatifs pour un échantillon de 1 ml dans un cryovial est d'environ 3 minutes.
  2. NE PAS laisser l'échantillon (s) au-dessus des températures chaudes réfrigérée (0-10 ° C). Lorsqu'elle est retirée de l'eau du bain, le cryovial (s) doit être froid au toucher.
  3. Diluer le mélange de cellules / CryoStor immédiatement avec les milieux de culture qui se situe entre 20 ° C et 37 ° C, en utilisant un taux de dilution de 1:10 ou plus de l'échantillon aux médias.
  4. Cellules de la plaque dans la configuration appropriée.
  5. Placer dans les cellules des conditions de culture ou d'utiliser immédiatement.
  6. Vingt-quatre heures après le dégel, d'évaluer les cellules pour leur viabilité.

4. Les résultats représentatifs

  1. Résultats de l'évaluation de la viabilité cellulaire dégel post-24 heures sont vus dans la figure 1. Comparer les résultats des cellules décongelées avec des non-congelés contrôles.

Figure 1
Figure 1. Recouvrement des fibroblastes humains après cryoconservation dans les milieux de culture traditionnelle / sérum / DMSO ou le sérum et sans protéines intracellulaires ressemblant CryoStor: fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF) ont été cryoconservés dans les milieux de culture / sérum / DMSO ou dans les médias cryoconservation CryoStor. Après leur décongélation, les cellules ont été autorisés à récupérer dans des conditions standard de culture (37 ° C / 5% de CO 2 / air humide) dans les médias de croissance des fibroblastes. Les cellules ont été dosées à 24 heures post-dégel avec alamarBlue pour bien évaluer la viabilité des cellules après la manifestation de processus apparition retardée mort cellulaire tels que l'apoptose et nécrose secondaire.

Discussion

Cette vidéo a démontré l'efficacité d'une solution de cryoconservation intracellulaire-comme la cryopréservation sans sérum et sans protéines en comparaison à un cryococktail traditionnelle à base de milieu de culture, le sérum et le DMSO. Comment congeler les cellules, les avantages d'utiliser une solution de cryoconservation intracellulaire-like, et un exemple de la façon d'évaluer la viabilité des cellules vrai après-dégel ont été décrites. Il est important de noter que parce que les cellules meurent par apoptose et nécrose post-dégel, sur une période de quelques heures à quelques jours, ce qui est observé que la viabilité perçu immédiatement après décongélation peut-être pas la viabilité à long terme vrai. Cette mort cellulaire apparition retardée peut ensuite influer sur la qualité de la prise de greffe de cellules et le recouvrement effectif des capacités fonctionnelles cellulaires, qui sont tous deux essentiels à la réussite de la cellule de cliniques et thérapeutiques des tissus.

Disclosures

Aby Mathew est employé par Solutions Biolife, Inc qui produit les réactifs utilisés dans cet article.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
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Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

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