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CryoStor Kryokonservierung Protocol

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

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Summary

CryoStor Kryokonservierung Lösungen werden verwendet, um vorzubereiten und zu bewahren Zellen in ultra Umgebungen mit niedrigen Temperaturen, ohne die Notwendigkeit für Serum, Proteine ​​oder hohe Zytostatika.

Abstract

Kryokonservierung Wirksamkeit - die nach dem Auftauen Erholung, Wirtschaftlichkeit und Funktionalität enthält, ist von Bedeutung für die Forschung und klinische Anwendungen. Die kumulative Belastungen, die aus der Kryokonservierung Prozess-und suboptimal einfrieren Medien führen zum Zelltod von Nekrose und Apoptose. 1-5 Zellen und Geweben hergestellt und kann erhalten in ultra Umgebungen mit niedrigen Temperaturen (-80 ° C bis -196 ° C) mit CryoStor Kryokonservierung Lösungen. Da diese Lösungen formuliert werden, um die molekularbiologische Aspekte der Zellen während der Kryokonservierung Prozess-Adresse, reduzieren sie das Niveau der Kryokonservierung induzierte verzögert einsetzende Zelltod und verbessert damit nach dem Auftauen die Lebensfähigkeit der Zellen und Funktion. Darüber hinaus müssen sie im Serum, Proteine ​​oder hohe Zytostatika ist mit diesem Protokoll beseitigt sind. In diesem Video-Artikel werden wir zeigen, die Verfahren für das Einfrieren, Lagerung und Auftauen der Zellen, sowie eine Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Auftauen.

Protocol

1. Vorbereitung von Zellen für Kryokonservierung

  1. Zur Vorbereitung für die Kryokonservierung, Platz Zellen in Suspension durch mechanische oder enzymatische Spaltung.
  2. Als nächstes Zentrifuge Zellen zu einem Zellpellet zu erhalten.
  3. Nach dem Zentrifugieren zu entfernen, da viel von der Kultur Medien Überstand wie möglich, zu einer Verwässerung des CryoStor Lösung, die im nächsten Schritt hinzugefügt werden zu reduzieren.
  4. Vor dem Öffnen der Flasche kaltes CryoStor Lösung, wischen Sie die Außenseite des Behälters mit 70% Ethanol.
  5. ISOLATION: In kalten CryoStor zu Zelle Konzentrationen von 0,5-10 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten.
  6. PRE-FREEZE: Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 2-8 ° C für ca. 10 Minuten.

2. Einfrieren und Lagern von Zellen

  1. So frieren die meisten Säugetierzellen Systeme, verwenden Sie ein Standard langsame kontrollierte Kühlung Protokoll mit einem Einfrieren Gerät oder Isopropanol Container vorgekühlt auf 2-8 ° C.
  2. Keimbildung: Freeze-Proben bei -80 ° C.
  3. Nach ca. 10 min. bei -80 ° C, initiieren Eisnukleation innerhalb der Probe (Seeding) bei ca. -5 ° C entweder mit einem flüssigen Stickstoff Burst Programm-Einstellung auf einer kontrollierten Rate Gefrierschrank oder mechanische Bewegung (Flick oder tippen) der Kryoröhrchen / Probenbehälter.
  4. Einfrieren der Zellen für 3-4 Stunden (für Isopropanol-Container).
  5. LAGERUNG: Für die langfristige Lagerung, Ort Proben bei Temperaturen des flüssigen Stickstoffs, unter -130 ° C. Probenlagerung bei -80 ° C ist nur für kurzfristige Lagerung von Wochen bis Monaten empfohlen.

3. Auftauen von Zellen

  1. Gefrorene Proben sollten schnell in einem 37 ° C Wasserbad aufgetaut werden. Vorsichtig schwenken die Probe (n), bis alle sichtbaren Eis geschmolzen ist. Die ungefähre Tauwetter Zeit für eine 1 mL Probe in einem Kryoröhrchen beträgt ca. 3 Minuten.
  2. Lassen Sie die Probe (n) oben gekühlt Temperaturen (0-10 ° C) warm. Wenn aus dem Wasserbad, das Kryoröhrchen (s) entfernt werden sollten kühl an.
  3. Verdünnen Sie die Zelle / CryoStor Mischung sofort mit Kulturmedien, die zwischen 20 ° C und 37 ° C ist, mit einer Verdünnung von 1:10 oder größer der Probe zu den Medien.
  4. Platte Zellen in der entsprechenden Konfiguration.
  5. Legen Sie Zellen in Kultur Bedingungen oder nutzen sofort.
  6. Vierundzwanzig Stunden nach dem Auftauen, beurteilen die Zellen für die Lebensfähigkeit.

4. Repräsentative Ergebnisse

  1. Die Ergebnisse der Lebensfähigkeit der Zellen Beurteilung 24-Stunden nach der Schneeschmelze sind in Abbildung 1 zu sehen. Vergleichen Sie die Ergebnisse der aufgetauten Zellen mit nicht eingefrorenen Kontrollen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Wiederherstellung des menschlichen Fibroblasten nach Kryokonservierung in der traditionellen Kultur Medien / Serum / DMSO oder die Serum-freien und Protein-freien intrazellulären wie CryoStor: normale menschliche Hautfibroblasten (NHDF) wurden in Kulturmedien / Serum / DMSO oder in CryoStor Kryokonservierung Medien kryokonserviert. Nach dem Auftauen wurden die Zellen ließ man bei Standard-Kulturbedingungen (37 ° C / 5% CO 2 / feuchte Luft) in Fibroblasten-Wachstumsfaktor Medien wiederherstellen. Die Zellen wurden bei 24 Stunden nach dem Auftauen mit alamarBlue getestet werden, um angemessen zu beurteilen Lebensfähigkeit der Zellen nach der Manifestation der verzögerten Beginn Zelltod Prozesse wie Apoptose und sekundären Nekrose.

Discussion

Dieses Video demonstriert die Kryokonservierung Wirksamkeit eines intrazellulären wie serumfreien und proteinfreien Kryokonservierung Lösung im Vergleich zu einem traditionellen cryococktail aus Kulturmedium, Serum und DMSO hergestellt. Wie Zellen Kryokonservierung wurden die Vorteile der Verwendung einer intrazellulären wie Kryokonservierung Lösung und ein Beispiel dafür, wie die wahre Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Auftauen zu beurteilen skizziert. Es ist wichtig zu beachten, dass, da die Zellen durch Apoptose und Nekrose nach dem Auftauen über einen Zeitraum von Stunden bis Tagen sterben, was als Perceived Viability sofort nach dem Auftauen zu beobachten kann nicht die wahre Lebensfähigkeit langfristig sein. Dies verzögert auftretende Zelltod kann anschließend auf die Qualität der Zelle Transplantation und die effektive Rückgewinnung von zellulären funktionalen Fähigkeiten, die beide entscheidend für den Erfolg der klinischen Zell-und Gewebe-Therapien sind.

Disclosures

Aby Mathew ist Biolife Solutions, Inc, daß das Reagenz in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
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Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

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