Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Application Notes

CryoStor cryopreservation פרוטוקול

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

Sign in to register to receive emails with product information.

Summary

CryoStor פתרונות cryopreservation משמשים להכנת ולשמר את התאים במיוחד לסביבות בטמפרטורה נמוכה, ללא צורך בסרום, חלבונים, או רמות גבוהות של חומרים ציטוטוקסיים.

Abstract

יעילות cryopreservation - הכולל שלאחר ההפשרה התאוששות, הכדאיות, ופונקציונליות היא בעלת חשיבות המחקר והן יישומים קליניים. מדגיש המצטבר כתוצאה מתהליך cryopreservation ולהקפיא התקשורת הכי מוצלח לגרום למוות התא נמק אפופטוזיס. 1-5 תאים ורקמות יכול להיות מוכן נשמר בטמפרטורה נמוכה במיוחד לסביבות (-80 ° C ל -196 ° C) באמצעות CryoStor cryopreservation פתרונות. מאז פתרונות אלה תוכננו כדי לענות על היבטים ביולוגיים מולקולריים של תאים במהלך תהליך cryopreservation, הם מורידים את רמת המוות מתעכב-onset cryopreservation-Induced התא, ובכך לשפר שלאחר ההפשרה הכדאיות התא ותפקודו. בנוסף, הם צריכים לכלול סרום, חלבונים, או רמות גבוהות של חומרים ציטוטוקסיים מסולק עם פרוטוקול זה. במאמר זה וידאו, נדגים את הליכי ההקפאה, אחסון הפשרה של תאים, כמו גם הערכת יכולת הקיום של תאים שלאחר ההפשרה.

Protocol

1. תאים הכנה cryopreservation

  1. כדי להתכונן, cryopreservation תאים לתוך מקום ההשעיה על ידי ניתוק מכני או אנזימטי.
  2. בשלב הבא, צנטריפוגה תאים כדי לקבל תא גלולה.
  3. לאחר צנטריפוגה, להסיר כמה שיותר את התקשורת בתרבות supernatant ככל האפשר, כדי להפחית את הדילול של התמיסה CryoStor, אשר יתווספו בשלב הבא.
  4. לפני פתיחת בקבוק פתרון CryoStor קר, נגבו את החלק החיצוני של המיכל עם אתנול 70%.
  5. בידוד: הוסף CryoStor קר לקבל תא ריכוזים של 0.5-10 x 10 6 תאים / מ"ל.
  6. PRE-FREEZE: לדגור על השעיית התא ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך כ 10 דקות.

2. הקפאה ושמירה תאים

  1. כדי להקפיא מערכות תא יונקים ביותר, השתמש קצב איטי תקן פרוטוקול קירור מבוקר עם מכשיר הקפאה או מיכל isopropanol מראש מקורר 2-8 ° C.
  2. נוקלאציה: דגימות להקפיא ב -80 ° C.
  3. לאחר כ 10 דקות. ב -80 ° C, ליזום נוקלאציה קרח בתוך המדגם (זריעה) בכ -5 מעלות צלזיוס או באמצעות חנקן נוזלי פרץ תוכנית ההגדרה במקפיא קצב תסיסה מבוקרת או מכני (קפיצי או ברז) של מיכל cryovial / מדגם.
  4. להקפיא את התאים במשך שעות 3-4 (עבור מכולה isopropanol).
  5. אחסון: עבור אחסון לטווח ארוך, דגימות מקום בטמפרטורות חנקן נוזלי, להלן -130 ° C. אחסון מדגם ב -80 ° C מומלץ רק עבור אחסון לטווח קצר של שבועות עד חודשים.

3. הפשרה תאים

  1. דגימות קפוא יש להפשיר במהירות באמבט מים C ° 37. בעדינות מערבולת המדגם (ים) עד שהקרח נמס לעין כל. זמן להפשיר משוער למדגם 1 מ"ל cryovial הוא כ 3 דקות.
  2. אין לאפשר את המדגם (ים) לחמם מעל טמפרטורה צונן (00-10 ° C). כאשר יוסר אמבט המים, cryovial (ים) צריך להיות קריר למגע.
  3. לדלל את תערובת תא / CryoStor מיד עם התקשורת והתרבות כי הוא בין 20 ° C ו -37 ° C, באמצעות יחס דילול של 1:10 או יותר מדגם התקשורת.
  4. פלייט תאים בתצורה המתאימה.
  5. המקום התאים לתוך התנאים תרבות או להשתמש מיד.
  6. עשרים וארבע שעות לאחר ההפשרה, להעריך את הכדאיות של תאים.

4. נציג תוצאות

  1. תוצאות של הערכת כדאיות תא 24 שעות ביממה שלאחר ההפשרה נראים באיור 1. השוואת תוצאות של תאים מופשר עם הלא קפוא שולטת.

איור 1
באיור 1. שחזור של fibroblasts האדם הבאים cryopreservation בתקשורת תרבות מסורתית / סרום / DMSO או סרום ללא וחלבון ללא תאיים כמו CryoStor: רגיל fibroblasts עורי האנושי (NHDF) היו cryopreserved בתקשורת תרבות / סרום / DMSO או בתקשורת CryoStor cryopreservation. בעקבות הפשרה, תאים הורשו להתאושש בתנאים תרבות סטנדרטי (37 ° C / 5% 2 / אוויר לח CO) בתקשורת צמיחה פיברובלסטים. תאים היו assayed ב 24 שעות שלאחר ההפשרה עם alamarBlue כדי להעריך כראוי כדאיות התא הבאים הביטוי של התא מתעכבת תחילת תהליכי מוות כמו אפופטוזיס ונמק משנית.

Discussion

סרט הווידאו הזה הוכיח את היעילות של פתרון cryopreservation תאיים כמו cryopreservation סרום ללא וחלבון ללא בהשוואה cryococktail מסורתי עשוי מדיום תרבות, סרום, ו DMSO. כיצד cryopreserve תאים, היתרונות של השימוש בפתרון תאיים כמו cryopreservation, ואת דוגמה כיצד להעריך את הכדאיות האמיתית של תאים שלאחר ההפשרה הותוו. חשוב לציין כי תאים מתים על ידי אפופטוזיס ונמק שלאחר ההפשרה על פני תקופה של שעות עד ימים, מה הוא ציין כפי שהוא נתפס מיד ההפשרה שלאחר ליכולת הקיום לא יכול להיות את הכדאיות האמיתית לטווח ארוך. זה מוות מושהה תא הופעת יכול לאחר מכן ההשפעה על איכות engraftment התא ההתאוששות יעיל של יכולות תפקודיות הסלולר, אשר שניהם הם קריטיים להצלחה של התא קליניים לטיפולים רקמות.

Disclosures

Aby מאתיו הוא מועסק על ידי Biolife Solutions, Inc המייצרת מגיב שימוש במאמר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
CryoStor cryopreservation פרוטוקול
Play Video

Cite this Article

Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter