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CryoStor cryopreservation प्रोटोकॉल

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

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Summary

CryoStor cryopreservation के समाधान के लिए तैयार है और अल्ट्रा कम तापमान वातावरण में कोशिकाओं को संरक्षित करने के लिए उपयोग किया जाता है, सीरम, प्रोटीन, या साइटोटोक्सिक एजेंटों के उच्च स्तर के लिए जरूरत के बिना.

Abstract

Cryopreservation प्रभावकारिता - जो बाद पिघलना वसूली, व्यवहार्यता और कार्यक्षमता भी शामिल है दोनों अनुसंधान और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए महत्व का है. संचयी तनाव है कि cryopreservation प्रक्रिया और परिगलन और apoptosis से कोशिका मृत्यु में suboptimal फ्रीज मीडिया परिणाम से परिणाम 1-5 कोशिकाओं और ऊतकों और तैयार किया जा सकता है अल्ट्रा कम तापमान वातावरण में संरक्षित (-80 ° सी -196 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग CryoStor cryopreservation समाधान. चूंकि इन समाधान के लिए cryopreservation की प्रक्रिया के दौरान आणविक जैविक कोशिकाओं के पहलुओं को संबोधित करने के लिए तैयार कर रहे हैं, वे cryopreservation प्रेरित सेल देरी शुरुआत मौत का स्तर कम है, जिससे बाद पिघलना सेल व्यवहार्यता और समारोह में सुधार. इसके अलावा, वे शामिल सीरम, प्रोटीन, या साइटोटोक्सिक एजेंटों के उच्च स्तर इस प्रोटोकॉल के साथ समाप्त की जरूरत है. इस वीडियो लेख में, हम ठंड, भंडारण, और कोशिकाओं के विगलन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बाद पिघलना कोशिकाओं के एक व्यवहार्यता मूल्यांकन के लिए प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करेंगे.

Protocol

1. Cryopreservation के लिए तैयारी कक्ष

  1. यांत्रिक या एंजाइमी हदबंदी द्वारा cryopreservation, निलंबन में जगह कोशिकाओं के लिए तैयार करने के लिए.
  2. अगला, कोशिकाओं एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए अपकेंद्रित्र.
  3. Centrifugation के बाद, के रूप में संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला संस्कृति मीडिया के बहुत दूर, CryoStor समाधान है जो अगले कदम में जोड़ दिया जाएगा के कमजोर पड़ने को कम.
  4. ठंड CryoStor समाधान की बोतल खोलने से पहले, नीचे 70% इथेनॉल के साथ कंटेनर के बाहर पोछ लो.
  5. अलगाव: 0.5-10 10 6 कोशिकाओं / एमएल एक्स सेल सांद्रता प्राप्त करने के लिए ठंड CryoStor में जोड़ें.
  6. पूर्व रुक: 2-8 पर सेल निलंबन सेते डिग्री सेल्सियस लगभग 10 मिनट के लिए.

2. बर्फ़ीली और भंडारण कक्ष

  1. सबसे स्तनधारी सेल प्रणाली को स्थिर करने के लिए, एक मानक धीमी गति नियंत्रित दर एक ठंड डिवाइस या isopropanol कंटेनर पूर्व ठंडा 2-8 करने के लिए डिग्री सेल्सियस के साथ ठंडा प्रोटोकॉल का उपयोग करें
  2. Nucleation: -80 पर रुक नमूनों डिग्री सेल्सियस
  3. लगभग 10 मिनट के बाद. -80 डिग्री सेल्सियस नमूने (बोने) के भीतर लगभग -5 पर बर्फ nucleation आरंभ डिग्री सेल्सियस या तो एक तरल नाइट्रोजन फट एक नियंत्रित दर फ्रीजर या cryovial / नमूना कंटेनर के यांत्रिक आंदोलन (झटका या नल) पर स्थापित प्रोग्राम का उपयोग.
  4. कोशिकाओं (isopropanol कंटेनर के लिए) 3-4 घंटे के लिए स्थिर.
  5. जल भंडारण के लिए: लंबी अवधि के भंडारण, तरल नाइट्रोजन तापमान नीचे -130 में जगह नमूने डिग्री सेल्सियस -80 पर नमूना भंडारण डिग्री सेल्सियस है ही सप्ताह के अल्पकालिक भंडारण के लिए महीने के लिए सिफारिश की है.

3. विगलन कक्ष

  1. जमे हुए नमूने एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जल्दी thawed चाहिए. धीरे ज़ुल्फ़ जब तक सभी दृश्यमान बर्फ नमूना (ओं) पिघल गया है. 1 cryovial में एमएल नमूने के लिए अनुमानित पिघलना समय लगभग 3 मिनट है.
  2. नमूना (ओं) को ठंडा तापमान (00-10 डिग्री सेल्सियस) के ऊपर गर्म करने की अनुमति नहीं करते. जब पानी के स्नान, cryovial (ओं) से हटा दिया छूने के लिए अच्छा होना चाहिए.
  3. मिश्रण / सेल CryoStor तुरंत संस्कृति मीडिया है कि 20 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस के बीच है के साथ पतला 1:10 की एक कमजोर पड़ने अनुपात या नमूना के मीडिया को अधिक से अधिक का उपयोग.
  4. उपयुक्त विन्यास में प्लेट कोशिकाओं.
  5. प्लेस कोशिकाओं संस्कृति शर्तों में या तुरंत का उपयोग.
  6. चौबीस बाद पिघलना घंटे, व्यवहार्यता के लिए कोशिकाओं का आकलन करते हैं.

4. प्रतिनिधि परिणाम

  1. सेल व्यवहार्यता मूल्यांकन 24 घंटे के बाद पिघलना परिणाम चित्रा 1 में देखा जाता है. गैर जमी नियंत्रण के साथ thawed कोशिकाओं के परिणामों की तुलना.

चित्रा 1
चित्रा 1. पारंपरिक संस्कृति / सीरम / DMSO या सीरम मुक्त और प्रोटीन से मुक्त intracellular तरह CryoStor मीडिया में मानव cryopreservation निम्नलिखित fibroblasts की वसूली: सामान्य मानव त्वचीय fibroblasts (NHDF) संस्कृति मीडिया / सीरम / DMSO में या CryoStor cryopreservation के मीडिया में cryopreserved थे. विगलन के बाद, कोशिकाओं fibroblast वृद्धि मीडिया में मानक संस्कृति शर्तों (37 °% / 5 सी सीओ हवा 2 / आर्द्र) में उबरने की अनुमति दी गई . कक्ष 24 के बाद पिघलना बजे alamarBlue साथ assayed उचित देरी apoptosis और माध्यमिक परिगलन जैसे शुरुआत कोशिका मृत्यु की प्रक्रिया की अभिव्यक्ति के बाद सेल व्यवहार्यता का आकलन थे.

Discussion

यह वीडियो एक पारंपरिक संस्कृति, मध्यम, सीरम, और DMSO से बना cryococktail की तुलना में एक intracellular तरह सीरम मुक्त और प्रोटीन से मुक्त cryopreservation समाधान के cryopreservation प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया. कैसे कोशिकाओं cryopreserve के लिए, एक intracellular तरह cryopreservation समाधान है, और कैसे बाद पिघलना की कोशिकाओं का यह सच व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए एक उदाहरण का उपयोग करने के लाभ रेखांकित किया गया. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि क्योंकि कोशिकाओं apoptosis और घंटे की अवधि में एक दिन के लिए पोस्ट - पिघलना परिगलन से मर जाते हैं, कथित व्यवहार्यता तुरंत बाद पिघलना के रूप में मनाया है क्या यह सच व्यवहार्यता लंबे समय तक नहीं किया जा सकता है है. इस देरी शुरुआत कोशिका मृत्यु के बाद जो दोनों के नैदानिक ​​सेल और ऊतक उपचार की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं सेल engraftment की गुणवत्ता और सेलुलर कार्य क्षमताओं के प्रभावी वसूली कर सकते हैं प्रभाव,.

Disclosures

Aby मैथ्यू Biolife समाधान, Inc कि इस लेख में इस्तेमाल किया अभिकर्मक उत्पादन के द्वारा नियोजित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

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References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
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Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

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