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CryoStor Crioconservazione protocollo

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

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Summary

CryoStor soluzioni crioconservazione vengono utilizzati per preparare e conservare le cellule in ambienti ultra bassa temperatura, senza la necessità di siero, le proteine, o alti livelli di agenti citotossici.

Abstract

Efficacia Crioconservazione - che comprende il recupero post-disgelo, la vitalità e la funzionalità è importante per entrambe le ricerche e le applicazioni cliniche. Gli stress cumulativo che risultano dal processo di crioconservazione e di congelare i media non ottimale risultato nella morte cellulare da necrosi e l'apoptosi. 1-5 cellule e tessuti possono essere preparati e conservati in ambienti ultra bassa temperatura (-80 ° C a -196 ° C) con CryoStor crioconservazione soluzioni. Dal momento che queste soluzioni sono formulati per affrontare gli aspetti di biologia molecolare delle cellule durante il processo di crioconservazione, riducono il livello di crioconservazione indotta insorgenza ritardata la morte delle cellule, migliorando così la post-disgelo vitalità delle cellule e la funzione. Inoltre, è necessario includere nel siero, proteine, o alti livelli di agenti citotossici viene eliminato con questo protocollo. In questo articolo video, viene mostrata la modalità di congelamento, archiviazione e scongelamento di cellule, così come una valutazione vitalità delle cellule post-disgelo.

Protocol

1. Le cellule preparando per Crioconservazione

  1. Per preparare per la crioconservazione, le cellule posto in sospensione da dissociazione meccanica o enzimatica.
  2. Successivamente, le cellule centrifuga per ottenere un pellet.
  3. Dopo la centrifugazione, rimuovere la maggior quantità di terreni di coltura surnatante possibile, per ridurre la diluizione della soluzione CryoStor, che saranno aggiunti nella fase successiva.
  4. Prima di aprire la bottiglia di soluzione CryoStor freddo, pulire la parte esterna del contenitore con il 70% di etanolo.
  5. ISOLAMENTO: Aggiungi CryoStor freddo per ottenere concentrazioni di cellule di 0,5-10 x 10 6 cellule / ml.
  6. PRE-FREEZE: incubare la sospensione cellulare a 2-8 ° C per circa 10 minuti.

2. Congelamento e conservare le cellule

  1. Per bloccare la maggior parte dei sistemi cellulari di mammifero, utilizzare un tasso standard lento controllato protocollo di raffreddamento con un dispositivo di congelamento o contenitore isopropanolo pre-raffreddata a 2-8 ° C.
  2. Nucleazione: Congelare i campioni a -80 ° C.
  3. Dopo circa 10 minuti. a -80 ° C, avviare nucleazione del ghiaccio all'interno del campione (semina) a circa -5 ° C con un liquido programma raffica di azoto impostazione su un congelatore velocità controllata o agitazione meccanica (film o toccare) del contenitore provetta Microbank ™ / campione.
  4. Congelare le cellule per 3-4 ore (per contenitore isopropanolo).
  5. STOCCAGGIO: Per conservazione a lungo termine, i campioni luogo alla temperatura dell'azoto liquido, sotto -130 ° C. Conservazione dei campioni a -80 ° C è raccomandata solo per deposito a breve termine di settimane o mesi.

3. Cellule scongelamento

  1. I campioni congelati vanno scongelati rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° C. Capovolgere delicatamente il campione (s), visibile fino a quando tutto il ghiaccio si è sciolto. Il tempo di disgelo approssimativo per un campione di 1 ml in una provetta Microbank ™ è di circa 3 minuti.
  2. NON permettere che il campione (s) per riscaldare sopra bassa temperatura (0-10 ° C). Quando rimosso dal bagno d'acqua, la provetta Microbank ™ (s) deve essere fresco al tatto.
  3. Diluire la cellula / CryoStor miscela immediatamente con terreni di coltura che è tra 20 ° C e 37 ° C, con un rapporto di diluizione 1:10 o maggiore di campione ai media.
  4. Cellule piastra nella configurazione appropriata.
  5. Cellule posto in condizioni di coltura o utilizzare immediatamente.
  6. Ventiquattro ore dopo il disgelo, valutare le cellule di redditività.

4. Rappresentante risultati

  1. Risultati della valutazione della vitalità cellulare 24 ore su disgelo post sono visto in Figura 1. Confrontare i risultati di cellule scongelate con i congelati controlli.

Figura 1
Figura 1. Recupero di fibroblasti umani dopo la crioconservazione in terreni di coltura tradizionali / siero / DMSO o senza siero e senza proteine ​​intracellulari di tipo CryoStor: fibroblasti umani normali dermica (NHDF) sono stati crioconservati in terreni di coltura / siero / DMSO o in CryoStor mezzi crioconservazione. Dopo lo scongelamento, le cellule sono stati autorizzati a recuperare in condizioni standard di coltura (37 ° C / 5% di CO 2 / aria umida) in terreni di crescita dei fibroblasti. Le cellule sono stati analizzati a 24 ore dopo il disgelo con alamarBlue per valutare in modo appropriato la vitalità cellulare in seguito alla manifestazione dei processi di morte cellulare insorgenza ritardata, come l'apoptosi e necrosi secondaria.

Discussion

Questo video dimostra l'efficacia crioconservazione di una simile soluzione intracellulare crioconservazione senza siero e priva di proteine ​​rispetto ad un tradizionale cryococktail fatto da terreno di coltura, siero, e DMSO. Come crioconservare le cellule, i benefici di utilizzare un intracellulare simile soluzione crioconservazione, e un esempio di come valutare la vitalità delle cellule Vero post-disgelo sono stati delineati. E 'importante notare che, poiché le cellule muoiono per apoptosi e necrosi post-disgelo in un periodo di ore o giorni, ciò che è osservato come percepito vitalità immediatamente post-disgelo non può essere la vera vitalità a lungo termine. Questo ritardo morte cellulare insorgenza può successivamente impatto sulla qualità di attecchimento delle cellule e l'effettivo recupero di cellulari capacità funzionali, che sono entrambi fondamentali per il successo della cellula clinico e terapie dei tessuti.

Disclosures

Aby Mathew è impiegato da Biolife Solutions, Inc che produce il reagente utilizzato in questo articolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
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Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

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