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CryoStor凍結保存プロトコル

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

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Summary

CryoStor凍結保存液を血清、タンパク質、または細胞毒性薬の高いレベルを必要とせずに、超低温環境下で細胞を調製し、保存するために使用されています。

Abstract

凍結保存の有効性 - 解凍後の復旧、実行可能性、および機能が含まれて研究と臨床応用の両方に重要である。凍結保存のプロセスと壊死とアポトーシスによる細胞死における次善の凍結のメディアの結果からその結果の累積的なストレス。1-5細胞や組織は、(° C -196 ° C -80)を用いて調製し、超低温環境で保存することができます。 CryoStor凍結保存ソリューション。これらのソリューションは、凍結保存の過程で細胞の分子生物学的側面に対処するために策定されているので、彼らはそれによって解凍後の細胞の生存と機能を改善する、凍結保存によって誘発される遅発性細胞死のレベルを減少させる。さらに、彼らはこのプロトコルを使用して除去される血清、タンパク質、または細胞毒性薬の高レベルを含める必要があります。このビデオの記事では、我々は細胞の凍結、ストレージ、および解凍するための手順、ならびに細胞解凍後の生存率評価のデモンストレーションを行います。

Protocol

1。凍結保存のためにセルを準備する

  1. 機械的または酵素的解離によって懸濁液に凍結保存、場所細胞の準備へ。
  2. 次に、細胞ペレットを得るために細胞を遠心してください。
  3. 遠心分離後、次のステップで追加されるCryoStorソリューション、の希釈を低減するため、可能な限り上清培地をできるだけ多く削除します。
  4. コー​​ルドCryoStorソリューションのボトルを開ける前に、70%エタノールで容器の外側を拭いてください。
  5. アイソレーション:0.5〜10 × 10 6細胞/ mLの細胞濃度を得るためにコールドCryoStorを追加する。
  6. PRE - FREEZE:2-8で細胞懸濁液をインキュベート℃で約10分間。

2。細胞の凍結と保存

  1. ほとんどの哺乳動物細胞系を凍結するには、冷凍装置またはイソプロパノールコンテナの事前冷却2-8℃で冷却プロトコルを制御する標準的な遅い速度を使用します。
  2. 核:凍結サンプル-80℃に
  3. 約10分後。 -80 ° Cで、℃の制御された速度の冷凍庫またはクライオバイアル/サンプル容器の機械的攪拌(フリックやタップ)のいずれか液体窒素のバーストのプログラム設定を使用して、約-5でサンプル(播種)の中で氷の核生成を開始する。
  4. 3-4時間のセルを(イソプロパノールコンテナ用)フリーズ。
  5. STORAG​​E:下記の長期保管、場所のサンプルを液体窒素温度では、-130 ° Cの-80℃のサンプル保管° Cだけ数週間から数カ月の短期記憶のために推奨されます。

3。解凍セル

  1. 凍結試料を37℃の水浴で急速に解凍してください。ゆっくりと表示されているすべての氷になるまで渦巻きサンプル(s)は溶融している。クライオバイアルに1 mLのサンプルのおおよその解凍時間は約3分です。
  2. サンプル(s)はチルド温度(0〜10 ° C)の上に温めるようにしてください。水浴、クライオバイアル(複数可)から削除するときにタッチのクールなはずです。
  3. 希釈1:10の比率やメディアへのサンプルの大きい方を使用して、20℃と37℃の間にある培地ですぐに細胞/ CryoStor混合物を希釈する。
  4. 適切な構成で細胞をプレート。
  5. 培養条件に細胞を配置したり、すぐに利用する。
  6. 二十四時間解凍後、実行可能性のためにセルを評価する。

4。代表的な結果

  1. 細胞の生存率の評価は24時間後の雪解けの結果を図1に見られている。非凍結のコントロールと融解後の細胞の結果を比較する。

図1
図1。従来の培地/血清/ DMSOで凍結保存後のヒト線維芽細胞の回復または無血清および無タンパク質細胞内のようなCryoStor:正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)培地/血清/ DMSOでまたはCryoStor凍結保存培地に凍結保存した。解凍後、細胞を線維芽細胞の増殖培地で標準培養条件(37℃/ 5%CO 2 /湿った空気)で回復させた。細胞は、適切にアポトーシスと二次壊死などの遅発性細胞死のプロセスの発現後の細胞生存率を評価するためにalamarBlueで24時間解凍後でアッセイした。

Discussion

このビデオでは、培養液、血清、およびDMSOから作られた伝統的なcryococktailと比較して細胞内のような無血清および無タンパク質凍結保存液の凍結保存の有効性を示した。細胞を凍結保存する方法、細胞内のような凍結保存液、および細胞解凍後の真の可能性を評価する方法の例を使用することの利点を概説した。細胞はすぐに知覚される生存率として観察されるもの、数時間から数日の期間にわたってアポトーシスとネクローシス解凍後で死ぬので、解凍後は、長期的な真の生存率ではないかもしれないことに注意することは重要です。この遅発性細胞死は、その後臨床細胞や組織の治療の成功に不可欠などちらも、細胞の生着の質と細胞の機能的な能力の効果的な回復に影響を与える可能性があります。

Disclosures

ABYマシューは、この記事で使用する試薬を生成するBiolifeソリューションズ、株式会社で採用されている。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

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References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
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Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

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