Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Application Notes

CryoStor Cryopreservation 프로토콜

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

Sign in to register to receive emails with product information.

Summary

CryoStor cryopreservation 솔루션은 약물, 단백질, 또는 세포 독성 대리인 높은 수준의 필요없이, 초저 온도 환경에서 세포를 준비하고 보존하는 데 사용됩니다.

Abstract

Cryopreservation의 효능 - 해동 후 복구, 생존 및 기능을 포함 연구 및 임상 응용에 모두 중요하다. 1-5 세포 조직이 (-80 ° C -196하는 ° C)를 사용하여 준비하고 초저 온도 환경에서 보존 수 cryopreservation 과정과 괴사와 apoptosis에서 세포의 죽음에 suboptimal 동결 미디어 결과에서 결과. 누적 스트레스 CryoStor cryopreservation 솔루션을 제공합니다. 이러한 해결책은 cryopreservation 과정에서 세포의 분자 생물 학적 측면을 해결하기 위해 공식화 있기 때문에, 그들은 따라서 이후 해동 세포 생존과 기능을 개선, cryopreservation 유발 지연 발병 세포 사망의 수준을 줄일 수 있습니다. 또한, 그들은이 프로토콜과 함께 멸망 약물, 단백질, 또는 세포 독성 대리인 높은 수준을 포함​​시킬 필요가 있습니다. 이 비디오를 문서에서, 우리는 냉동, 스토리지 및 세포의 융해,뿐만 아니라 세포 포스트 해동의 생존 능력 평가를위한 절차를 보여줄 것입니다.

Protocol

1. Cryopreservation 준비 셀

  1. 기계적 또는 효소 분해에 의해 서스펜션에 cryopreservation, 장소 전지를 준비합니다.
  2. 다음, 세포가 세포 펠렛을 얻기 위해 원심 분리기.
  3. 원심 분리 후, 다음 단계에서 추가됩니다 CryoStor 솔루션의 희석을 줄이기 위해, 가능한 한 뜨는 문화 매체만큼을 제거합니다.
  4. 감기 CryoStor 솔루션의 병을 열기 전에, 70 % 에탄올로 용기의 외부를 닦으십시오.
  5. 절연 0.5-10 × 10 6 세포 / ML의 세포 농도를 얻기 위해 추운 CryoStor를 추가합니다.
  6. 예약 - 꼼짝마 : 2-8에 세포 현탁액을 품어 ° C 약 10 분.

2. 셀을 냉동 및 보관

  1. 대부분의 포유 동물 세포 시스템을 동결, 냉동 장치 또는 이소프로판올 컨테이너 사전 냉각 2-8로 ° C.와 냉각 프로토콜을 제어하는​​ 표준 느린 속도를 사용
  2. 핵 : -80에서 프리즈 샘플 ° C.
  3. 약 10 분 후. -80에서 ° C, 약 -5에서 샘플 (시딩) 내에 얼음 핵을 시작 ° C 제어 속도 냉동기 또는 cryovial / 샘플 용기의 기계적 교반 (영화 또는 탭)에 설정하거나 액체 질소 버스트 프로그램을 사용합니다.
  4. 3-4시간에 대한 세포 (이소프로판올 컨테이너) 프리즈.
  5. 저장 용량 : 장기 보관, 아래의 액체 질소 온도, -130에서 장소 샘플 ° C. -80에서 샘플 보관 ° C에서만 개월 주 단기 저장을 위해 좋습니다.

3. 해동 셀

  1. 냉동 샘플은 37 ° C의 물을 욕조에 신속하게 해동한다. 부드럽게 소용돌이는 모든 보이는 얼음까지 샘플 (S)이 녹아 있습니다. cryovial에 1 ML 샘플에 대한 대략적인 해동 시간은 약 3 분 거리에 있습니다.
  2. 샘플 (S)는 냉장 온도 (0-10 ° C) 이상의 따뜻한 것을 허용하지 않습니다. 물 목욕, cryovial (S)에서 제거하면 시원한해야합니다.
  3. 희석 1시 10분의 비율 또는 미디어 샘플의 이상을 사용하여 20 ° C와 37 ° C 사이에 문화 매체와 즉시 휴대폰 / CryoStor 혼합물을 희석.
  4. 적절한 구성의 플레이트 세포.
  5. 문화 조건에 장소 전지는 즉시 활용합니다.
  6. 24 시간 이후의 해동은 생존을 위해 세포를 평가.

4. 대표 결과

  1. 세포 생존 능력 평가 24 시간 게시물 해동의 결과는 그림 1에서 볼 수 있습니다. 비 - 냉동 컨트롤 해동 세포의 결과를 비교할 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 전통 문화 미디어 / 혈청 / DMSO 또는 혈청 - 무료 단백질이없는 세포와 같은 CryoStor에 cryopreservation에 따라 인간의 섬유아 세포의 복구 : 정상적인 인간 피부 섬유아 세포 (NHDF)은 문화 미디어 / 혈청 / DMSO 또는 CryoStor cryopreservation 미디어에 cryopreserved되었습니다. 해동 후, 세포는 fibroblast의 성장 미디어의 표준 문화 조건 (37 ° C / 5% CO 2 / 습한 공기)에서 복구할 수있었습니다. 전지는 적절하게 이러한 apoptosis 및 보조 괴사와 같은 지연 발병 세포 사망 프로세스의 발현 다음과 세포 생존을 평가하기 위해 alamarBlue와 24시간 후 해동에서 assayed되었습니다.

Discussion

이 동영상은 문화 매체, 혈청, 그리고 DMSO 만든 전통 cryococktail에 비해 세포와 같은 혈청 - 무료 단백질 무료 cryopreservation 솔루션의 cryopreservation의 효능을 보여주었다. 세포를 cryopreserve하는 방법 세포와 같은 cryopreservation 솔루션, 그리고 세포 사후 해동의 진정한 가능성을 평가하는 방법에 대한 예제를 사용의 장점은 설명했다. 세포가 일 몇 시간의 기간 동안 apoptosis와 괴사 후 해동하여 죽기 때문에, 어떻게 인식 생존 즉시 사후 해동으로 관찰하는 것이 장기적으로 진정한 생존되지 않을 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 이 지연 발병 세포 죽음 이후 임상 세포 및 조직 요법의 성공에 중요 둘의 세포 engraftment의 품질과 세포 기능의 효과적인 기능을 회복 영향을 줄 수 있습니다.

Disclosures

Aby 매튜는이 문서에서 사용되는 시약을 생산 Biolife 솔루션, Inc의 고용이다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
CryoStor Cryopreservation 프로토콜
Play Video

Cite this Article

Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter