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Application Notes

CryoStor protocolo de crioconservación

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

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Summary

CryoStor soluciones de criopreservación se utilizan para preparar y conservar las células de ultra baja temperatura ambiente, sin la necesidad de suero, proteínas o altos niveles de agentes citotóxicos.

Abstract

Eficacia de la criopreservación - que incluye la recuperación después de la descongelación, la viabilidad y funcionalidad es de gran importancia para la investigación y aplicaciones clínicas. Las tensiones acumuladas que resultan del proceso de criopreservación y la congelación de los medios de comunicación óptimo resultado en la muerte celular por necrosis y apoptosis. 1.5 Células y tejidos pueden ser preparadas y conservadas en la ultra ambientes de baja temperatura (-80 ° C a -196 ° C) con CryoStor criopreservación soluciones. Dado que estas soluciones están formulados para tratar los aspectos de la biología molecular de las células durante el proceso de criopreservación, que reducen el nivel de la criopreservación de la muerte celular inducida de aparición tardía, lo que mejora después de la descongelación la viabilidad celular y su función. Además, tienen que incluir las proteínas del suero, o los altos niveles de agentes citotóxicos se elimina con este protocolo. En este artículo de video, vamos a demostrar los procedimientos de congelación, almacenamiento y descongelación de las células, así como una evaluación de la viabilidad de las células después de la descongelación.

Protocol

1. Las células de la preparación de Criopreservación

  1. Para prepararse para la criopreservación de las células de lugar, en suspensión por disociación mecánica o enzimática.
  2. A continuación, centrifugar las células para obtener un pellet de células.
  3. Después de la centrifugación, eliminar la mayor cantidad de los medios de cultivo sobrenadante como sea posible, para reducir la dilución de la solución CryoStor, que se sumarán en el siguiente paso.
  4. Antes de abrir la botella de solución de CryoStor frío, limpiar la superficie exterior del recipiente con etanol al 70%.
  5. AISLAMIENTO: Añadir CryoStor frío para obtener las concentraciones de células de 0,5-10 x 10 6 células / ml.
  6. PRE-Freeze: Incubar la suspensión celular a 2-8 º C durante unos 10 minutos.

2. Congelación y almacenamiento de las células

  1. Para congelar la mayoría de los sistemas de células de mamíferos, utilice una velocidad estándar de protocolo de enfriamiento lento controlado con un dispositivo de congelación o contenedor isopropanol previamente enfriado, a 2-8 º C.
  2. Nucleación: congelar las muestras a -80 ° C.
  3. Después de aproximadamente 10 min. a -80 ° C, iniciar la nucleación de hielo dentro de la muestra (siembra) a unos -5 º C usando un programa de líquido estallido de nitrógeno en el establecimiento de un congelador de velocidad controlada o agitación mecánica (película o del grifo) del contenedor criovial / muestra.
  4. Congelar las células durante 3-4 horas (para el contenedor de isopropanol).
  5. ALMACENAMIENTO: Para almacenamiento a largo plazo, las muestras a temperaturas de nitrógeno líquido, por debajo de -130 ° C. Almacenamiento de las muestras a -80 ° C se recomienda solamente para almacenamiento a corto plazo de semanas o meses.

3. Las células deshielo

  1. Las muestras congeladas deben ser descongeladas rápidamente en un baño de agua a 37 ° C. Remover con suavidad la muestra (s) hasta que todo el hielo se ha derretido visible. El tiempo aproximado para descongelar una muestra de 1 ml en un criovial es de aproximadamente 3 minutos.
  2. NO permita que la muestra (s) para calentar encima de las temperaturas refrigeradas (0-10 º C). Cuando se saca del baño de agua, el criovial (s) debe ser fresca al tacto.
  3. Diluir la mezcla de células / CryoStor inmediatamente con los medios de cultivo que se encuentra entre 20 ° C y 37 ° C, con una relación de dilución de 1:10 o mayor de la muestra a los medios de comunicación.
  4. Células de la placa en la configuración adecuada.
  5. Células de lugar en las condiciones de cultivo o utilizar de inmediato.
  6. Veinticuatro horas después de la descongelación, las células de evaluar su viabilidad.

4. Los resultados representativos

  1. Los resultados de la evaluación de la viabilidad celular 24 horas después de deshielo se ve en la Figura 1. Comparar los resultados de las células descongeladas con controles no congelados.

Figura 1
Figura 1. Recuperación de los fibroblastos humanos después de la crioconservación en medios de cultivo tradicionales y / o suero / DMSO o el suero libre de proteínas y libre intracelular, como CryoStor: normal fibroblastos dérmicos humanos (NHDF) fueron criopreservados en medios de cultivo y / o suero / DMSO o en los medios de comunicación CryoStor criopreservación. Una vez descongelados, las células se les permitió recuperarse en condiciones normales de cultivo (37 ° C / 5% CO 2 / húmedo) en los medios de crecimiento de fibroblastos. Las células se analizaron en 24 horas post-descongelación con alamarBlue para evaluar adecuadamente la viabilidad celular después de la manifestación de los procesos de retraso en la aparición de muerte celular, como la apoptosis y la necrosis secundaria.

Discussion

Este video demuestra la eficacia de la criopreservación de una solución de criopreservación intracelular, como libre de suero y proteína libre en comparación con un cryococktail tradicionales elaborados con medio de cultivo, suero y DMSO. ¿Cómo de criopreservar las células, los beneficios de utilizar una solución de criopreservación intracelular-como, y un ejemplo de la forma de evaluar la viabilidad de las células verdadero deshielo post-fueron descritos. Es importante señalar que debido a que las células mueren por apoptosis y necrosis después de la descongelación durante un período de horas o días, lo que se observa como la viabilidad percibida inmediatamente después de la descongelación puede no ser la verdadera viabilidad a largo plazo. Esta muerte celular inicio retrasado posteriormente puede afectar la calidad del injerto celular y la recuperación efectiva de las capacidades funcionales de celulares, los cuales son críticos para el éxito de las clínicas y terapias de células del tejido.

Disclosures

Aby Mathew es empleado por las soluciones Biolife, Inc, que produce el reactivo utilizado en este artículo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

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References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
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Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

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