Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Application Notes

CryoStor Frysförvaring Protokoll

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

Sign in to register to receive emails with product information.

Summary

CryoStor frysförvaring lösningar används för att förbereda och bevara celler i extremt låga temperaturer, utan behov av serum, proteiner, eller höga halter av cytostatika.

Abstract

Frysförvaring effekt - vilket inkluderar efter upptining återhämtning, livskraft och funktionalitet är av betydelse för både forskning och kliniska tillämpningar. Den kumulativa betonar att resultatet av frysförvaring processen och suboptimala medier frysa resulterar i celldöd från nekros och apoptos. 1-5 Celler och vävnader kan förberedas och förvaras i extremt låga temperaturer (-80 ° C till -196 ° C) med CryoStor frysförvaring lösningar. Eftersom dessa lösningar är utformade för att hantera de molekylärbiologiska aspekter av celler under frysförvaring processen, de minskar graden av frysförvaring-inducerad fördröjd debut celldöd och därigenom förbättra post-tina cellernas livskraft och funktion. Dessutom måste de inkludera serum, proteiner, eller höga halter av cytostatika elimineras med detta protokoll. I den här videon artikel kommer vi att visa rutiner för nedfrysning, förvaring och upptining av celler, samt en livskraft bedömning av cellerna efter tö.

Protocol

1. Förbereda celler för Frysförvaring

  1. För att förbereda frysförvaring, placera celler i suspension med mekaniska eller enzymatisk dissociation.
  2. Nästa, centrifug celler för att få en cellpellet.
  3. Efter centrifugering, ta bort så mycket av kulturen medier supernatanten som möjligt, för att minska utspädning av CryoStor lösning, som kommer att läggas till i nästa steg.
  4. Innan du öppnar flaskan med kallt CryoStor lösning, torka av utsidan av behållaren med 70% etanol.
  5. ISOLATION: Lägg kallt CryoStor att få cellen koncentrationer av 0,5-10 x 10 6 celler / ml.
  6. PRE-Frys: Inkubera cellsuspensionen vid 2-8 ° C i ca 10 minuter.

2. Frysning och lagring av celler

  1. Att frysa de flesta däggdjursceller system använder en vanlig långsam kylning protokoll med en frysning enhet eller isopropanol behållare nedkylda till 2-8 ° C.
  2. Kärnbildning: Frys proverna vid -80 ° C.
  3. Efter ca 10 min. vid -80 ° C, initiera is kärnbildning i provet (seeding) vid ca -5 ° C med hjälp av antingen ett flytande program kväve brast inställning på en kontrollerad takt frys eller mekanisk omrörning (bläddra eller knacka) av cryovial / provbehållaren.
  4. Frys cellerna i 3-4 timmar (för isopropanol behållare).
  5. LAGRING: För långtidsförvaring, placera proverna i flytande kväve temperaturer under -130 ° C. Exempel på förvaring vid -80 ° C rekommenderas bara för kortvarig förvaring av veckor till månader.

3. Upptining av celler

  1. Frysta prover ska tinas snabbt i 37 ° C vattenbad. Vagga försiktigt prov (er) tills alla synliga isen har smält. Den ungefärliga tina tid för en 1 ml prov i en cryovial är cirka 3 minuter.
  2. Låt inte prov (er) till varma ovan kylda (0-10 ° C). När de tas bort ur vattenbadet, den cryovial (s) bör vara sval vid beröring.
  3. Späd cellen / CryoStor blandningen omedelbart med kultur media som är mellan 20 ° C och 37 ° C, med en utspädning på 1:10 eller större prov till media.
  4. Plate celler i lämplig konfiguration.
  5. Placera celler i kultur villkor eller använda omedelbart.
  6. Tjugofyra timmar efter upptining, bedöma celler för livskraft.

4. Representativa resultat

  1. Resultat av cellviabiliteten bedömning 24 timmar efter upptining ses i figur 1. Jämför resultat av den upptinade celler med icke-frysta kontroller.

Figur 1
Figur 1. Återvinning av mänskliga fibroblaster efter frysförvaring i traditionell kultur media / serum / DMSO eller serumfritt och protein-fri intracellulära-liknande CryoStor: normal människa dermal fibroblaster (NHDF) var frysförvarade i kultur media / serum / DMSO eller CryoStor frysförvaring medier. Efter upptining fick celler tillåts att återhämta sig på vanliga odlingsbetingelser (37 ° C / 5% CO 2 / fuktig luft) i media fibroblast tillväxt. Cellerna analyserades vid 24 timmar efter tina med alamarBlue göra en korrekt bedömning cellviabiliteten efter manifestationen av försenade död debut cell processer såsom apoptos och sekundär nekros.

Discussion

Denna video visade frysförvaring effekten av en intracellulär-liknande serumfritt och protein-fri frysförvaring lösning i jämförelse med en traditionell cryococktail gjorda av odlingsmedium, serum och DMSO. Hur cryopreserve celler, var fördelarna med att använda en intracellulär-liknande frysförvaring lösning och ett exempel på hur man bedöma den verkliga livskraft celler efter tina beskrivs. Det är viktigt att notera att eftersom cellerna dör genom apoptos och nekros efter tina under en period av timmar till dagar, kan vad som observerats som Upplevd livskraft direkt efter tina inte vara äkta livskraft på lång sikt. Detta fördröjd celldöd kan sedan påverka kvaliteten i cellen engraftment och effektiv indrivning av cellulära funktionell kapacitet, som båda är avgörande för framgångarna inom den kliniska cell-och terapier vävnad.

Disclosures

Aby Mathew är anställd av BioLife Solutions, Inc som producerar reagens som används i denna artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
CryoStor Frysförvaring Protokoll
Play Video

Cite this Article

Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter