Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Application Notes

CryoStor Kriyoprezervasyon Protokolü

doi: 10.3791/2206 Released: October 7, 2010
Aby Mathew1
1BioLife Solutions, Inc.

Sign in to register to receive emails with product information.

Summary

CryoStor kriyoprezervasyon çözümleri, serum, proteinler, veya sitotoksik ajanlar yüksek düzeylerde ihtiyaç duymadan, ultra düşük sıcaklıktaki ortamlarda hücreler hazırlamak ve muhafaza etmek için kullanılır.

Abstract

Kriyoprezervasyon etkinliği-çözülme sonrası kurtarma, canlılığı ve işlevselliğini içerir, araştırma ve klinik uygulamalarda hem de önemi. 1-5 Hücreler ve dokular (-80 ° C -196 ° C) kullanılarak hazırlanmış ve ultra düşük sıcaklıktaki ortamlarda korunmuş olabilir kriyoprezervasyon süreç ve hücre ölümü nekroz ve apoptozis suboptimal dondurma medya kaynaklanan kümülatif gerilmeler CryoStor kriyoprezervasyon çözümleri. Bu çözümler dondurulması işlemi sırasında hücreler moleküler biyolojik yönleriyle ele formüle olduklarından, böylece-çözülme sonrası hücre canlılığı ve fonksiyonu iyileştirilmesi, kriyoprezervasyon-bağlı geç başlangıçlı hücre ölümü düzeyini azaltmak. Buna ek olarak, bu protokol ile ortadan serum, proteinler, ya da sitotoksik ajanlar yüksek düzeyde eklemeniz gerekir. Bu video makalede, dondurma, depolama ve hücre çözülme yanı sıra hücrelerin-çözülme sonrası bir canlılığı değerlendirme prosedürlerini ortaya koyacak.

Protocol

1. Hücreler Kriyoprezervasyon için hazırlanması

  1. Mekanik ya da enzimatik ayrılma dondurulması, yer hücreleri süspansiyon hazırlamak için.
  2. Daha sonra, hücreleri bir hücre pelet elde etmek için santrifüj.
  3. Santrifüj sonra, bir sonraki adımda eklenecek CryoStor çözüm, seyreltme azaltmak için, mümkün olduğu supernatant kültür ortamı kadar çıkarın.
  4. Soğuk CryoStor çözüm şişe açmadan önce,% 70 etanol ile kabın dışına aşağı doğru silin.
  5. İZOLASYON: 0.5-10 x 10 6 hücre / ml hücre konsantrasyonları elde etmek için soğuk CryoStor ekleyin.
  6. PRE-FREEZE: hücre süspansiyonu 2-8 ° C'de yaklaşık 10 dakika.

2. Donma ve Depolama Hücreleri

  1. En memeli hücre sistemleri dondurmak için, donmuş bir cihaz veya izopropanol konteyner önceden soğutulmuş için 2-8 ° C soğutma protokol kontrol edilen bir standart yavaş kullanın
  2. Çekirdeklenme: Freeze numuneler -80 ° C
  3. Yaklaşık 10 dakika sonra. -80 ° C, yaklaşık -5 örneği (ekim) içinde buz çekirdeklenme başlatmak ° C kontrollü bir oranda dondurucu veya mekanik cryovial / numune kabı ajitasyon (fiske veya dokunun) ayarını ya da sıvı nitrojen patlama programı kullanarak.
  4. 3-4 saat hücreleri (izopropanol konteyner) dondurun.
  5. DEPOLAMA: uzun vadeli depolama için yer örnekleri aşağıda sıvı azot sıcaklık, -130 ° C Örnek depolama -80 ° C sadece ay, hafta kısa vadeli depolama için tavsiye edilir.

3. Çözülme Hücreler

  1. Donmuş numuneler 37 ° C su banyosunda hızla çözdürülmelidir. Yavaşça girdap tüm görünür buz kadar numune (ler) eritti. Bir cryovial 1 ml örnek için yaklaşık çözülme süresi yaklaşık 3 dakikadır.
  2. Örnek (ler), soğuk sıcaklıklarda (0-10 ° C) üstünde sıcak izin vermeyin. Su banyosu, cryovial (ler) kaldırılır dokunmak için serin olmalıdır.
  3. Seyreltme 1:10 oranı ya da medyaya örnek daha fazla kullanarak, 20 ° C ve 37 ° C arasında kültür ortamı hücre / CryoStor karışımı hemen sulandırınız.
  4. Levha hücreleri uygun yapılandırma.
  5. Kültür koşullarında ya Yeri hücreler hemen kullanmaktadır.
  6. Yirmi dört saat-çözülme, hücreleri canlılığını değerlendirmek.

4. Temsilcisi sonuçları

  1. Hücre canlılığı değerlendirmesi 24 saat sonrası çözülme sonuçları Şekil 1'de görülmektedir. Dondurulmuş olmayan kontroller ile çözülmüş hücreler sonuçları karşılaştırın.

Şekil 1
Şekil 1. Geleneksel kültür medya / serum / DMSO veya serum ücretsiz ve protein içermeyen hücre içi gibi CryoStor kriyoprezervasyon insan fibroblastlar Kurtarma: normal insan dermal fibroblastlar (NHDF), kültür medya / serum / DMSO ya da CryoStor kriyoprezervasyon medya Kriyoprezerve. Eritilmeyi müteakip, hücreleri fibroblast büyüme ortamı standart kültür koşullarında (37 ° C /% 5 CO 2 / nemli hava) kurtarmak için izin verildi. Hücreler uygun, apoptoz ve ikincil nekroz gibi geç başlangıçlı hücre ölüm süreçlerinin tezahürü hücre canlılığını değerlendirmek için alamarBlue-çözülme sonrası 24 saat olarak ölçüldü.

Discussion

Bu video, kültür ortamı, serum ve DMSO yapılan geleneksel bir cryococktail karşılaştırma bir hücre içi gibi serum serbest ve protein içermeyen kriyoprezervasyon çözüm dondurulması etkinliğini göstermiştir. Hücreleri cryopreserve nasıl bir hücre içi gibi kriyoprezervasyon çözüm ve hücreleri-çözülme sonrası Gerçek Canlılık değerlendirmek için nasıl bir örnek kullanmanın yararları ana hatlarıyla. Hücrelerin apoptoz ve nekroz-çözülme sonrası gün saat bir süre içinde ölmektedir, çünkü ne Algılanan Canlılık hemen sonrası çözülme olarak görülmektedir Gerçek Canlılık uzun vadeli olmayabilir olabilir dikkat etmek önemlidir. Bu geç başlangıçlı hücre ölümü daha sonra her ikisi de klinik hücre ve doku tedavileri başarısı için kritik, hücre engraftman kalite ve hücresel fonksiyonel yeteneklerini etkin kurtarma etkileyebilir.

Disclosures

Aby Mathew Bu makalede kullanılan reaktif üretir Biolife Solutions, Inc tarafından istihdam edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza Inc.
Fibroblast Growth Media Lonza Inc.
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H9269
TrypLE Express GIBCO, by Life Technologies
Centrifuge tubes Sigma-Aldrich T1818
Culture Flask Sigma-Aldrich C7231
96-well microplates Sigma-Aldrich M0687
CryoStor Sigma-Aldrich
DMSO - USP grade Sigma-Aldrich D7941
Cryovials Sigma-Aldrich V4757
Nalgene Mr. Frosty freezing container Sigma-Aldrich C1562
-80°C Freezer VWR international
Liquid Nitrogen dewar VWR international
Liquid Nitrogen Praxair, Inc.
Waterbath VWR international
alamarBlue TREK Diagnostics, Thermo Scientific
Tecan Fluorescent Plate Reader Tecan Group Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathew, A.J. I m Losing Cell Viability and Function at Different Points in My Process, and I Don t Know Why! BioProcess International 8(6), 54-7 (2010).
  2. Baust, J.M., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Van Buskirk, R.G., Baust, J.G. Steps to Improving Cryopreservation Outcome: Understanding Key Factors Influencing Efficacy. Bioscience Technology (2006).
  3. Van Buskirk, R.G., Snyder, K.K., Mathew, A.J., Baust, J.G., Baust, J.M. Navigating the post-preservation viability fog. Genetic Engineering News 38-39 (2006).
  4. VanBuskirk, R.G., Snyder, K.K., Baust, J.G., Mathew, A.J., Baust, J.M. Cryopreservation: it s not just about cell yield. BioProcess International 2-8 (2005).
  5. Snyder, K.K., VanBuskirk, R.G., Baust, J.M., Mathew, A.J., Baust, J.G. Biological packaging for the global cell and tissue therapy markets. BioProcessing Journal 1-7 (2004).
CryoStor Kriyoprezervasyon Protokolü
Play Video

Cite this Article

Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).More

Mathew, A. CryoStor Cryopreservation Protocol - ADVERTISEMENT. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e2206, (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter