Summary
संयंत्र कोशिकाओं के बीच macromolecular तस्करी transiently ब्याज की एक प्रोटीन fluorescently टैग व्यक्त और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा अपने अंतर और कहनेवाला वितरण का विश्लेषण करके मूल्यांकन किया जा सकता है.
Abstract
यहाँ, हम एक सरल और तेजी से सेल सेल Planta में macromolecular परिवहन की सीमा का पता लगाने और आकलन के लिए प्रोटोकॉल उपस्थित थे. इस प्रोटोकॉल में, एक fluorescently ब्याज की टैग प्रोटीन transiently अपने एन्कोडिंग डीएनए के biolistic निर्माण प्रसव के बाद संयंत्र के ऊतकों में व्यक्त किया. टैग प्रोटीन का अंतर और कहनेवाला वितरण तो confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया है. हम विस्तार में इस प्रौद्योगिकी का वर्णन है, परख के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करने और तीन प्रजातियों के पौधे में symplastic प्रोटीन परिवहन की हद तक, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana और एन का मूल्यांकन tabacum (तम्बाकू).
Protocol
पृष्ठभूमि
संयंत्र कहनेवाला कनेक्शन के माध्यम से बड़े अणुओं के Symplastic परिवहन, plasmodesmata, कई संयंत्र pathologists और जीव के लिए ब्याज की है. उदाहरण के लिए, कई वायरल प्रोटीन plasmodesmal आकार अपवर्जन सीमा को विनियमित करने के लिए वायरल आंदोलन 1-3 सक्षम करने के लिए जाना जाता है. इसके अलावा, उन्हें महत्वपूर्ण विकास नियामकों के बीच कुछ अंतर्जात प्रोटीन, सेल से सेल को स्थानांतरित करने, plasmodesmata के माध्यम से शायद, 4 गैर सेल autonomously समारोह ग्रहण कर रहे हैं . इस प्रकार, की पहचान करने और संयंत्र कोशिकाओं के बीच macromolecular परिवहन कल्पना के लिए एक विश्वसनीय पद्धति में काफी मांग है.
1) लक्ष्य पौधों आगे बढ़ें
उच्च परिवर्तन दक्षता के लिए, स्वस्थ, मजबूत पौधों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
1. Arabidopsis पौधों
एक पर्यावरण नियंत्रित कक्ष में एक छोटी photoperiod (130-150 μE मीटर एस -2 प्रकाश -1 के 8 घंटा 23 के साथ एक बर्तन में BX प्रो - मिक्स (10 सेमी x 10 सेमी x 10 सेमी) पर Arabidopsis संयंत्र विकसित करने ° C/16 घंटा अंधेरा 20 पर ° सी) और 6 से 8 5 हफ्तों के लिए 40-65% सापेक्ष आर्द्रता. उन्हें व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादों के साथ कभी कभी के रूप में 5 वर्णित खाद . 15 मिमी x 35 मिमी (लंबाई माप डंठल शामिल) की तुलना में बड़े आकार के साथ पत्तियां प्रयोगों के लिए चयन कर रहे हैं.
2 एन benthamiana और एन tabacum
एक पर्यावरण नियंत्रित चैम्बर में (20 सेमी x 20 सेमी x 20 सेमी) एक लंबे photoperiod (23 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटा μE 130-150 मीटर -2 एस -1 प्रकाश के साथ बर्तन में प्रो मिक्स BX पर एक संयंत्र विकसित / 20 में 8 अंधेरे घंटा ° सी) और 7 से 10 हफ्तों के लिए 40-65% सापेक्ष आर्द्रता. उन्हें कभी कभी खाद वर्णन के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादों के साथ. आकार एन के लिए 50 मिमी से बड़ी x 70 मिमी के साथ पत्तियां benthamiana, या एन के लिए 100 मिमी x 125 मिमी tabacum (इन लंबाई माप डंठल शामिल नहीं हैं) प्रयोगों के लिए चयन कर रहे हैं.
2 जीन गन कारतूस के डीएनए लेपित सोने के साथ) तैयार microparticles
इस प्रायोगिक चरण के लिए प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित किया गया है 6 पहले. यह बहुत महत्वपूर्ण है उच्च सांद्रता (प्रयोग के बाद के चरणों के दौरान confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण में आसानी के लिए ~ / μg μl 1) उच्चतम परिवर्तन दक्षता प्राप्त करने के लिए पर अच्छी तरह से शुद्ध प्लास्मिड डीएनए का उपयोग करें.
इस परख के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि तैयार कारतूस उच्च आवृत्ति पर दो या अधिक सन्निकट कक्षों नहीं बदलना करता है एक साथ पता लगाने के लिए, क्योंकि एक फ्लोरोसेंट संकेत क्लस्टर के साथ जोड़ कोशिकाओं की संख्या symplastic परिवहन की हद तक (यानी की एक संकेतक के रूप में प्रयोग किया जाता है संकेत युक्त एक एकल कक्ष में कोई आंदोलन का संकेत है, जबकि एक multicell संकेत क्लस्टर आंदोलन इंगित करता है). प्रत्येक कारतूस की गुणवत्ता प्रोटीन 16-20 घंटे पोस्ट बमबारी की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके जाँच की जा सकती है. हमारे 6 प्रोटोकॉल कारतूस कि केवल <3% इस समय सीमा में सभी को अभिव्यक्ति की घटनाओं की, इस प्रकार इस प्रयोग के लिए उपयुक्त में multicell अभिव्यक्ति समूहों उपज पैदा करता है.
3) डीएनए लेपित microparticles के Biolistic डिलिवरी
- एक तेज धार के साथ ही विकास मंच (यानी एक ही आकार और एक ही उम्र के साथ, चरण 1 देखें) की पत्तियों निकालें और तुरंत उन्हें abaxial पक्षों के साथ एक फ्लैट स्टायरोफोम सतह पर ऊपर का सामना करना पड़ जगह. पत्ती के abaxial पक्ष में अपनी कम trichome घनत्व और पतले छल्ली की वजह से बमबारी के लिए एक बेहतर सब्सट्रेट का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि उनके अपेक्षाकृत छोटे आकार के Arabidopsis पत्ते, खिड़की के परदे जाल का एक टुकड़ा के साथ कवर किया जाना चाहिए, और जाल तो pushpins के साथ सुरक्षित स्टायरोफोम सतह. बनाए रखने पत्ते है फ्लैट कण डिलीवरी की क्षमता बढ़ जाती है है और microbombardment दौरान ऊतकों को नुकसान कम से कम.
- डीएनए लेपित microparticles (चरण 1 में तैयार) के साथ बंदूक में कारतूस डालें. Arabidopsis के लिए, शूटिंग 80-110 साई के दबाव पर 1-सुक्ष्ममापी microparticles और 140-160 साई के लिए 0.6-सुक्ष्ममापी microparticles के लिए किया जाता है . एन के लिए benthamiana और तम्बाकू, शूटिंग 100-120 साई के दबाव पर 1-सुक्ष्ममापी microparticles और 160-180 साई के लिए 0.6-सुक्ष्ममापी microparticles के लिए किया जाता है. Arabidopsis के लिए, हम आमतौर पर पत्ती के प्रति एक कारतूस का उपयोग, क्योंकि प्रत्येक पत्ती केवल एक शॉट है जो व्यास में 10-12 मिमी के एक क्षेत्र पर microparticles फैलता के लिए पर्याप्त सतह क्षेत्र है. बड़ा एन के साथ benthamiana और तम्बाकू के पत्ते, वही पत्ती के एकाधिक bombardments संभव हो रहे हैं, तथापि, वे मध्य रिब ही विकास के चरण में पत्ती क्षेत्रों को लक्षित (चर्चा देखें) के प्रत्येक पक्ष पर सममित पदों पर किया जाना चाहिए .
- स्टायरोफोम सतह से पत्तियों निकालें और उन्हें मैं जगहगीला वाटमान फिल्टर पेपर के 3 परतों पर नहीं एक पेट्री डिश, Parafilm पेट्री डिश के साथ सील, और यह कमरे के तापमान पर 36-48 घंटा के लिए दिया और उनके प्रोटीन उत्पादों की transgenes सेल सेल आंदोलन संभावित की अभिव्यक्ति की अनुमति सेते .
4) प्रोटीन अभिव्यक्ति की इमेजिंग
transiently व्यक्त टैग प्रोटीन का फ्लोरोसेंट संकेत confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना है. देखभाल के लिए प्रत्येक परीक्षण प्रोटीन का पता लगाने के लिए इष्टतम माइक्रोस्कोपी सेटिंग्स मिल लिया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, प्रोटीन है कि तम्बाकू मोज़ेक वायरस आंदोलन प्रोटीन (TMV सांसद) 1-3,6 plasmodesmal स्थानीयकरण के रूप में कमजोर संकेत तीव्रता के साथ सीमित intracellular संचय दिखाने, एक 40x उद्देश्य लेंस, जो उच्च संकल्प और परमिट के तहत मनाया जाना चाहिए संवेदनशीलता, जबकि प्रोटीन है कि मुक्त YFP जैसे मजबूत संकेत तीव्रता, के साथ cytoplasmic वितरण दिखाने तेजी इमेजिंग के लिए confocal समारोह ज़ूम के साथ एक 10X उद्देश्य लेंस (चित्रा 1 देखें) के तहत कल्पना किया जा सकता है.
Symplastic परिवहन multicell समूहों है कि फ्लोरोसेंट संकेत होते हैं की उपस्थिति से inferred है. ऐसे समूहों के प्रत्येक क्लस्टर में और कोशिकाओं की संख्या संख्या सेल के लिए सेल के परिवहन की हद तक का संकेत है. विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए, कम से कम 100 अभिव्यक्ति समूहों प्रत्येक प्रायोगिक प्रणाली के प्रति दर्ज किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, यदि एक प्रोटीन की सेल सेल आंदोलन दो अलग आनुवंशिक (उदाहरण के लिए, जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक पौधों) कुल 200 अभिव्यक्ति समूहों की पृष्ठभूमि में की तुलना में दर्ज किया जाना चाहिए. महत्वपूर्ण बात है, प्रयोगों, जिनमें से एक अन्य की तुलना में हो सकता है, परिणाम बाहर एक साथ किया जाना चाहिए.
5. प्रतिनिधि परिणाम
नीचे आंकड़ा fluorescently टैग प्रोटीन के symplastic परिवहन का पता लगाने के के लिए प्रतिनिधि प्रयोगों दिखाता है. पैनलों A और B ठेठ confocal छवियों है कि एक एन के निम्नलिखित microbombardment प्राप्त कर रहे हैं बताते हैं TMV सांसद YFP व्यक्त के साथ benthamiana पत्ती का निर्माण. पैनल में ए, TMV सांसद - YFP के symplastic आंदोलन YFP संकेत के multicell समूहों की उपस्थिति के आधार पर मनाया जाता है. करने के लिए कदम के रूप में कुछ microbombardments (पैनल बी) में एकल कोशिका संकेत द्वारा evidenced सक्षम नहीं है सभी transiently व्यक्त सांसद YFP TMV. आंकड़ों में <गिना संकेत समूहों के 40%, सांसद YFP TMV जबकि कोशिकाओं के बीच स्थानांतरित करने में असमर्थ है> समूहों के 60%, प्रोटीन 2-5 कोशिकाओं के बीच दो सेल प्रसार सबसे अक्सर के साथ जा रहा है, चाल (ca. ~ 50% मामलों) (चित्रा 1C).
पीडी के माध्यम से सहज आंदोलन गतिविधि के बिना अपेक्षाकृत छोटे आकार के साथ आणविक प्रोटीन फैलाना सेल के लिए सेल को स्थानांतरित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, मुफ्त YFP, या 1xYFP (ca. 27 केडीए, पैनल डी), गिना समूहों (पैनल सी) के 30% में कई कोशिकाओं के बीच फैलता है. यह गैर विशिष्ट प्रसार translational YFP dimmer, या (54 केडीए, पैनल ई) 2xYFP, जो TMV सांसद YFP संलयन प्रोटीन (57 केडीए) के आकार में बराबर है, और जो पूरी तरह से सेल स्वायत्त के लिए नहीं होती है (चित्रा 1C).
चित्रा 1 एन में symplastic परिवहन परख से प्राप्त विशिष्ट परिणामों benthamiana पत्ता ऊतकों. सांसद YFP TMV के विज़ुअलाइज़ेशन (ए, बी). (सी) संकेत समूहों के quantitation. 1xYFP और 2xYFP, मुफ्त YFP और translational YFP डिमर, क्रमशः. (डी) 1xYFP के विज़ुअलाइज़ेशन. (ई) 2xYFP के विज़ुअलाइज़ेशन. Micrographs में, बाईं पैनल YFP संकेत दिखाने के लिए और सही पैनल YFP के विलय छवियों (हरे रंग में) और chloroplast autofluorescence संकेतों (सफेद) बताते हैं. छवियाँ एकल confocal वर्गों रहे हैं. Micrographs में तारांकन epidermal कोशिकाओं YFP संकेत दिखा दिखा. बार्स = 50 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
symplastic परिवहन परख की सफलता के लिए कुंजी को उच्च परिवर्तन दक्षता है, जो सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है और आसानी से detectible संकेत समूहों के उत्पादन की अनुमति देता प्राप्त है. यह स्वस्थ, मजबूत पौधों से काटा पत्तियों का उपयोग, और एक शुद्ध और केंद्रित डीएनए तैयारी द्वारा लेपित सोने कणों की तैयारी हासिल किया जा सकता है.
समान विकास के चरण में पत्तियों का उपयोग भी परख विश्वसनीयता के लिए महत्वपूर्ण है. Plasmodesmal एपर्चर करने के लिए विभिन्न 7-11 ऊतक के विकास मंच के आधार पर विनियमित किया जाना जाता है. कई प्रजातियों के पौधे की पत्तियों basipetally विकास, सुप्रीम आधार करने के लिए, अपने बेसल हिस्सा 12 से अधिक परिपक्व किया जा रहा पत्ती के शिखर भाग के साथ . इस प्रकार, न केवल पत्ते (आम तौर पर उनके आकार और स्टेम स्थान पर परिलक्षित) प्रयोगों के प्रत्येक सेट के लिए चयनित विकास मंच के समान हो, लेकिन चाहिए पत्ता microbombardment द्वारा लक्षित क्षेत्रों में समान पदों पर स्थित होना चाहिए.
कुछ पहले के अध्ययनों सेल स्वायत्त मार्करों, जैसे endoplasmic जालिका सीमित (erGFP) GFP 11, कार्यरत है उन लोगों के लिए जो परीक्षण प्रोटीन symplastic परिवहन के द्वारा ले जाया गया है से शुरू बदल कोशिकाओं भेद. हालांकि, बाद में एक अध्ययन से पता चला erGFP के साथ कुछ गैर सेल स्वायत्त प्रोटीन की है कि एक साथ अभिव्यक्ति अपने सेल के लिए सेल 13 आंदोलन प्रेरित प्रारंभिक परिवर्तन मार्कर के रूप में erGFP की विश्वसनीयता पर सवाल कर सकता है और काफी हद से डेटा की व्याख्या में कठिनाई बढ़ रही है ऐसे coexpression प्रयोगों. इस प्रकार, हम हमारे आंदोलन परख में एक और प्रोटीन की अभिव्यक्ति शुरू से बचने के पसंद करते हैं, और, बजाय, संकेत क्लस्टर संख्या के सांख्यिकीय विश्लेषण पर भरोसा करते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हमारा काम NIH / NIGMS, NSF, USDA NIFA /, और चारण से कुलपति को अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | |
| Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | |
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | |
| Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
References
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