Summary
植物細胞の間に高分子の人身売買は、一過性の関心の蛍光タグ融合タンパク質を発現し、共焦点顕微鏡によるその内および細胞間の分布を分析することによって評価することができます。
Abstract
ここで、我々は、 植物体中の細胞間の高分子輸送の範囲を検出し、評価するために簡単かつ迅速にプロトコルを提示する。このプロトコルでは、関心の蛍光標識タンパクが一時的にそのエンコーディングのDNA構築物の遺伝子銃送達後の植物組織に発現しています。タグタンパク質の内と細胞間の配布は、共焦点顕微鏡で分析される。我々は、アッセイにステップバイステップのプロトコルを提供する、詳細にこの技術を説明し三植物種のsymplasticタンパク質輸送の範囲、 シロイヌナズナ 、 タバコbenthamianaとNを評価するアナタバカム （タバコ）。
Protocol
背景
植物細胞間の接続を介して高分子のSymplastic輸送、原形質連絡は、多くの植物病理学者と生物学者のためのものです。例えば、いくつかのウイルスタンパク質は、ウイルスの動き1-3を有効にするplasmodesmalサイズ排除限界を調節することが知られている。また、それらの重要な発達の規制当局の間でいくつかの内在性タンパク質は、非細胞自律的に4を機能させるには、おそらく原形質連絡を介して、セルからセルに移動すると仮定されています。従って、植物細胞の間に高分子輸送を特定し、視覚化する信頼性の高い方法論は非常に需要があります。
1）対象となる植物を育てる
高い形質転換効率については、健康な、堅牢な植物を使用する必要があります。
（1） シロイヌナズナの植物
短い光周期（130から150μEM -2 s -1の光の8時間、23℃での環境制御室内にポットでプロミックスBXの1つのシロイヌナズナの植物を（10センチ× 10センチメートル× 10 cm）に成長する40から65 C/16時間20時暗い° C）、6〜8週間5％の相対湿度。 5を説明するように、市販製品と時折それらを受精させる。 15ミリメートル× 35 mm（長さの測定は葉柄を含む）より大きいサイズを持つ葉は実験のために選択されています。
2。N. benthamianaとN.アナタバカム
長い光周期（23 ° Cで130から150μEM -2 s -1の光の16時間と環境制御室内のポット（20センチ× 20センチメートル× 20センチメートル）でプロミックスBXの1つの植物を育てる/ 8 20時暗い時間° C）および7〜10週間の40から65パーセントの相対湿度。記述として市販の製品と時折それらを受精させる。 Nの50ミリメートル× 70 mmを超えるサイズの葉Nのbenthamiana、または100ミリメートル× 125ミリメートルアナタバカムは、（これらの長さの測定は、葉柄が含まれていない）実験のために選択されています。
DNAでコーティングされた金微粒子による遺伝子銃のカートリッジの2）の調製
この実験的なステップのためのプロトコルは、以前は次の6詳細に記載されている。それは高濃度（〜の1μg/μl）の実験の後の段階での共焦点顕微鏡分析を容易にするために最も高い形質転換効率を得るためによく精製されたプラスミドDNAを使用することが非常に重要です。
蛍光シグナルのクラスタと関連付ける細胞の数がsymplastic輸送（すなわちの程度の指標として使用されるので、このアッセイの場合、それは、準備カートリッジは高い周波数で同時に二つ以上の隣接するセルを変換しないことを確認することが重要です。マルチセル信号のクラスタは、動きを示すのに対し、信号を含む単一セル）は、何の動きがないことを示します。各カートリッジの品質は、タンパク質16〜20時間の後の砲撃の発現を分析することによって確認することができます。我々のプロトコル6はこの実験のため、適切なこの時間枠のすべての式のイベントの<3％、でマルチセル式のクラスタを生成カートリッジを生成します。
DNAでコーティングされた微粒子の3）バイオリスティックデリバリー
- 鋭いカミソリの刃と同じ発達段階（つまり、同じサイズと同じ年齢で、ステップ1を参照）の葉を取り除くとすぐに平らな発泡スチロールの表面に上向きに背軸側面に配置してください。葉の背軸側は、その下のトリコーム密度と薄くキューティクルによる爆撃のためのより良い基質を表します。 シロイヌナズナの葉は、それらの比較的小さいサイズの、ウィンドウのスクリーンメッシュの部分で覆われているはず、とメッシュがその後画鋲で固定するため発泡スチロールの表面に。葉が平らな維持は、粒子のデリバリーの効率が向上し、microbombardment中の組織への損傷を最小限に抑えます。
- 銃へのDNA -被覆微粒子（ステップ1で調製した）でカートリッジを挿入します。 シロイヌナズナの場合、撮影は1μmの微粒子のための80から110 psiの圧力、および0.6μmの微粒子のための140から160 psiで実行されます。 Nのbenthamianaとタバコは、撮影は1μmの微粒子のための100から120 psiの圧力、および0.6μmの微粒子のための160から180 psiで実行されます。それぞれの葉だけ直径10〜12 mmの領域の上に微粒子を広げる1回の撮影で十分な表面積を持っているのでシロイヌナズナの場合、我々は通常、葉ごとに一つのカートリッジを利用する。大きいNとbenthamianaとタバコの葉は、同じ葉の複数の爆撃が可能な、しかし、彼らは（説明を参照）と同じ発生段階で葉の領域をターゲットに半ばリブの両側にある左右対称の位置に行う必要があります。
- 発泡スチロールの表面から葉を取り出して、それらに私を置いてウェットワットマンろ紙の3層ではなくペトリ皿は、パラフィルムでシャーレをシールし、そのタンパク質産物の納入導入遺伝子と細胞間移行の可能性の発現を可能にするために36〜48時間室温で振とうする。
4）タンパク質発現のイメージングは、
一過性に発現タグタンパク質の蛍光シグナルは、共焦点顕微鏡により視覚化です。ケアは、各試験蛋白質の検出に最適な顕微鏡の設定を見つけるに注意する必要があります。たとえば、タバコモザイクウイルスの移行タンパク質（TMV MP）1-3,6のplasmodesmal局在のような弱い信号強度、と限定された細胞内蓄積を示すタンパク質は、高い解像度とに支払う40X対物レンズ、下に観察する必要があります感度は、そのような自由なYFPなどの強いシグナル強度と細胞質の分布を示すタンパク質のに対し、（図1参照）より高速なイメージングのための共焦点ズーム機能で10倍の対物レンズ下で可視化することができます。
Symplastic輸送は、蛍光シグナルを含む、マルチセルクラスタの外観から推測されます。各クラスター内のクラスターやセルの数の数は、細胞間輸送の程度の指標である。信頼性の高いデータを取得するには、少なくとも100の発現のクラスターは、各実験系ごとに記録されるべきである。例えば、タンパク質の細胞間移行が合計200の発現のクラスターの二つの異なる遺伝的背景（例えば、野生型およびトランスジェニック植物）、で比較されている場合は、記録すべきである。重要なのは、実験、相互に比較されることになっているの結果は、同時に行われるべきである。
5。代表的な結果
下の図は、蛍光タグタンパク質のsymplastic輸送を検出するための代表的な実験を示しています。パネルAおよびBは、Nの次のようmicrobombardmentを得ている典型的な共焦点画像を表示TMV MP - YFPを発現するとbenthamianaの葉は、構築する。パネルではTMV MP - YFPの、symplastic動きはYFPのシグナルのマルチセルクラスタの外観に基づいて観測される。すべて一過性に発現しないTMV MP - YFPは、いくつかのmicrobombardmentsの単一セルの信号（パネルB）によって証明されるように移動することができます。統計的に、で<カウント信号クラスタの40％は、TMV MP - YFPは、一方のセル間を移動することができないで>クラスタの60％、タンパク質は2つのセルの拡散が最も頻繁にされて、2-5細胞間を移動（約〜50％の症例）（図1C）。
生来の運動活動せず、比較的小さな分子サイズを持つタンパク質は、細胞間を移動するためにPDを通して拡散することができます。例えば、フリーYFP、または1xYFPは（約27 kDaの、パネルD）、カウントのクラスタ（パネルC）の30％で、いくつかの細胞間に広がっています。この非特異的な拡散は、TMV MP - YFP融合タンパク質（57 kDa）のためにサイズに匹敵する、と完全に細胞自律的である並進YFPの調光器、または2xYFP（54 kDaの、パネルE）、は発生しません（図1C）。
図1。N.でsymplastic輸送アッセイから得られた典型的な結果benthamiana葉組織。 TMV MP - YFPの（A、B）可視化。信号クラスターの（C）定量。 1xYFPと2xYFP、それぞれ自由なYFPと並進YFPダイマー、。 1xYFPの（D）可視化。 2xYFPの（E）可視化。顕微鏡写真で、左パネルはYFPシグナルを示し、右側のパネルには、マージされたYFPの画像（緑の）と葉緑体の自家蛍光（白の）信号を示します。画像は、単一の焦点セクションです。顕微鏡写真の中のアスタリスクは、YFPのシグナルを示す表皮細胞を示す。バー= 50μmの。
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Discussion
symplastic輸送アッセイの成功の鍵は、統計的に有意かつ容易に検出可能信号クラスターの生産を可能にする高い形質転換効率を、得ることである。これは健康な、堅牢な植物から収穫された葉を使用して、そして純粋な、そして濃縮したDNAの調製により被覆された金粒子を準備達成することができます。
同じ成長段階で葉を使用しても、アッセイの信頼性にとって不可欠です。 Plasmodesmal開口部は差動組織7-11の発達段階に応じて、規制されることが知られている。多くの植物種の葉は、その基底部12よりも成熟している葉の先端部と、頂点からベースに、basipetally開発する。従って、実験の各セットに対して選択された葉の発達段階（通常は幹でそのサイズと位置によって反射）だけが同じになる必要がありますが、microbombardmentの対象となる葉の領域は、同一の位置に配置する必要があります。
いくつかの以前の研究では、どのテスト蛋白質はsymplastic交通機関で移動したために、それらから最初に形質転換された細胞を区別するために小胞体係留GFP（erGFP）11、のような細胞自律的なマーカーを、採用している。しかし、その後の研究ではerGFPといくつかの細胞非自律的なタンパク質のその同時発現は、初期変換マーカーとしてerGFPの信頼性を問う、その細胞間移動13を誘導し、実質的にデータの解釈の難しさを増加させることが示されたこのような共発現実験。従って、我々は運動アッセイに別のタンパク質の発現を導入しないようにすることを好む、そして、代わりに、信号のクラスタ番号の統計分析に依存しています。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
私たちの仕事は、NIH / NIGMS、NSF、USDA / NIFA、とBARDからVCへの補助金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | |
| Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | |
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | |
| Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
References
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