Summary
Macromoleculaire de handel tussen de plantencellen kan worden beoordeeld door kortstondig te drukken een fluorescent-gelabeld eiwit van belang en de analyse van de intra-en intercellulaire distributie door confocale microscopie.
Abstract
Hier presenteren wij een eenvoudige en snelle protocol op te sporen en te beoordelen van de mate van cel-cel macromoleculaire transport in planta. In dit protocol is een fluorescent gelabeld eiwit van belang tijdelijk, uitgedrukt in plantenweefsel na biolistische levering van haar coderend DNA te construeren. De intra-en intercellulaire verdeling van de gelabelde eiwit wordt vervolgens geanalyseerd door confocale microscopie. We beschrijven deze technologie in detail, het verstrekken van stap-voor-stap protocollen test en evaluatie van de mate van symplastic eiwit transport in drie plantensoorten, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana en N. tabacum (tabak).
Protocol
Achtergrond
Symplastic transport van macromoleculen door de plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata, is van belang voor veel plant-pathologen en biologen. Bijvoorbeeld, zijn verschillende virale eiwitten waarvan bekend is dat plasmodesmal size exclusion grenzen te reguleren, zodat virale beweging 1-3. Ook zijn sommige endogene proteïnen, waaronder belangrijke ontwikkeling toezichthouders, aangenomen om van cel naar cel, vermoedelijk door plasmodesmata, tot niet-cel-autonoom 4-functie. Dus een betrouwbare methode te identificeren en te visualiseren macromoleculaire vervoer tussen plantencellen is veel vraag naar is.
1) Groei van de doelsoorten behorende planten
Voor hoge efficiëntie van de omzetting, moet een gezonde, robuuste planten worden gebruikt.
1. Arabidopsis-planten
Grow een Arabidopsis plant op Pro-Mix BX in een pot (10 cm x 10 cm x 10 cm) in een omgeving gecontroleerde kamer met een korte lichtperiode (8 uur van 130 tot 150 μE m -2 s -1 licht bij 23 ° C/16 uur donker bij 20 ° C) en 40-65% relatieve vochtigheid gedurende 6 tot 8 weken 5. Zo nu en dan bemesten ze met de handel verkrijgbare producten zoals beschreven 5. Bladeren met de grootte groter dan 15 mm x 35 mm (de lengte is inclusief steel) zijn geselecteerd voor de experimenten.
2. N. benthamiana en N. tabacum
Grow een plant op Pro-Mix BX in een pot (20 cm x 20 cm x 20 cm) in een omgeving gecontroleerde kamer met een lange lichtperiode (16 hr van 130-150 μE m -2 s -1 licht bij 23 ° C / 8 uur donker bij 20 ° C) en 40-65% relatieve vochtigheid voor 7 tot 10 weken. Zo nu en dan bemesten ze met commercieel verkrijgbare producten te beschrijven. Bladeren met groter dan 50 mm x 70 mm voor N. benthamiana, of 100 mm x 125 mm voor N. tabacum (deze lengte metingen omvatten niet de steel) zijn geselecteerd voor de experimenten.
2) Voorbereiding van de Gene Gun inktcartridge met DNA-gecoate Gold micropartikels
Het protocol voor deze experimentele stap is in detail beschreven eerder 6. Het is zeer belangrijk om goed gezuiverde plasmide DNA te gebruiken bij hoge concentraties (~ 1 ug / ul) tot het hoogste transformatie efficiëntie te verkrijgen voor het gemak van confocale microscopie analyse tijdens de latere stadia van het experiment.
Voor deze test is het belangrijk om na te gaan dat de voorbereide cartridge niet twee of meer aangrenzende cellen simultaneously te transformeren in een hoge frequentie, omdat het aantal cellen te associëren met een fluorescerende signaal cluster wordt gebruikt als een indicator voor de mate van symplastic vervoer (dat wil zeggen , een enkele cel die het signaal geeft aan geen beweging, terwijl een multicel signaal cluster geeft aan beweging). De kwaliteit van de elke cartridge kan worden gecontroleerd door analyse van de expressie van het eiwit 16-20 uur na bombardement. Ons protocol 6 produceert cartridges die multicel uitdrukking clusters opbrengst alleen bij <3% van alle expressie gebeurtenissen in deze periode, dus geschikt voor dit experiment.
3) biolistische Levering van DNA-coating micropartikels
- Verwijder de bladeren van dezelfde ontwikkelingsfase (dwz met dezelfde grootte en dezelfde leeftijd, zie stap 1) met een scherp scheermesje en direct te plaatsen met de abaxiale zijkanten omhoog op een vlakke ondergrond piepschuim geconfronteerd. De abaxiale kant van het blad staat voor een beter substraat voor bombardement te wijten aan de lagere trichome dichtheid en dunnere cuticula. Arabidopsis bladeren, vanwege hun relatief geringe omvang, moeten worden gedekt met een stuk hor gaas, en het gaas dan beveiligd met pushpins aan het piepschuim oppervlak. Behoud van bladeren vlak verhoogt de efficiëntie van het deeltje levering en minimaliseert de schade aan het weefsel tijdens het microbombardment.
- Plaats de cartridge met DNA-gecoate microdeeltjes (opgesteld in stap 1) in het geweer. Voor Arabidopsis, is het schieten uitgevoerd bij een druk van 80 tot 110 psi voor 1-um microdeeltjes, en 140 tot 160 psi voor 0,6-um microdeeltjes. Voor N. benthamiana en tabak, is het schieten uitgevoerd bij een druk van 100-120 psi voor 1-um microdeeltjes, en 160 tot 180 psi voor de 0,6-um microdeeltjes. Voor Arabidopsis, we meestal gebruik maken van een cartridge per blad, omdat elk blad heeft genoeg oppervlakte slechts voor een schot, die micropartikels verspreidt over een gebied van 10-12 mm in diameter. Bij grotere N. benthamiana en tabaksbladeren, meerdere bombardementen van hetzelfde blad mogelijk zijn, echter, moeten ze worden gedaan bij de symmetrische posities op elke zijde van het midden van de rib aan het blad aan te pakken in dezelfde ontwikkelingsfase (zie Discussie).
- Haal de bladeren van de piepschuim oppervlakte en plaats ze iniet een petrischaal op 3 lagen nat Whatman filter papier, zegel de petrischaal met Parafilm, en incubeer bij kamertemperatuur voor 36 tot 48 uur om de expressie van de geleverde transgenen en de potentiële cel-cel beweging van hun eiwitproducten maken .
4) Beeldvorming van eiwitexpressie
De fluorescerende signaal van de tijdelijk uitgedrukt gemerkte eiwitten wordt gevisualiseerd door confocale microscopie. Zorg moet worden genomen om optimale microscopie instellingen te vinden voor de detectie van elke geteste eiwit. Bijvoorbeeld, eiwitten die beperkte intracellulaire accumulatie show met zwak signaal intensiteiten, zoals de plasmodesmal lokalisatie van de tabak mozaïek virus beweging eiwit (TMV MP) 1-3,6, moet worden waargenomen onder een 40X objectief lens, die een hogere resolutie en biedt gevoeligheid, terwijl eiwitten die cytoplasmatische verdeling te tonen met een sterk signaal intensiteiten, zoals gratis YFP, kan worden gevisualiseerd in een 10x objectief met confocale zoom-functie voor snellere beeldvorming (zie figuur 1).
Symplastic vervoer is afgeleid uit het verschijnen van multicel clusters die het fluorescerende signaal bevatten. Het aantal van dergelijke clusters en het aantal cellen in elke cluster is een indicatie van de mate van cel-cel transport. Voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens, moet ten minste 100 uitdrukking clusters worden opgenomen per elke experimentele systeem. Bijvoorbeeld, moet als de cel-cel beweging van een eiwit wordt vergeleken in twee verschillende genetische achtergronden (bijvoorbeeld wild type en transgene planten), met een totale 200 uitdrukking clusters worden opgenomen. Belangrijk is, experimenten, moeten de resultaten van die moeten worden met elkaar vergeleken, worden gelijktijdig uitgevoerd.
5. Representatieve resultaten
De figuur hieronder illustreert representatieve experimenten voor het opsporen van symplastic transport van fluorescent gelabelde eiwitten. Panelen A en B tonen de typische confocale beelden die zijn verkregen na microbombardment van een N. benthamiana blad met een TMV MP-YFP tot expressie te construeren. In paneel A, symplastic beweging van TMV MP-YFP wordt waargenomen gebaseerd op de verschijning van multicel clusters van de YFP signaal. Niet alle tijdelijk uitgedrukt TMV MP-YFP is in staat zich te bewegen zoals blijkt uit de single-cell-signaal in sommige microbombardments (paneel B). Statistisch gezien bij <40% van de getelde signaal clusters, TMV MP-YFP niet in staat is om te bewegen tussen de cellen, terwijl bij> 60% van de clusters, het eiwit beweegt zich tussen 2-5 cellen, met de twee-cel zich als de meest voorkomende (ca. ~ 50% van de gevallen) (figuur 1C).
De eiwitten met relatief kleine moleculaire grootte, zonder aangeboren beweging activiteit kan diffunderen door PD tot cel-cel te verplaatsen. Bijvoorbeeld gratis YFP of 1xYFP (ca. 27 kDa, paneel D), spreads tussen verschillende cellen in 30% van de getelde clusters (panelen C). Deze niet-specifieke diffusie treedt niet op bij een translationeel YFP dimmer, of 2xYFP (54 kDa, paneel E), die in omvang vergelijkbaar is met TMV MP-YFP fusie-eiwit (57 kDa), en die volledig is cel-autonoom (Figuur 1C).
Figuur 1. Typische resultaten van de symplastic transport test in N. benthamiana blad weefsels. (A, B) Visualisatie van TMV MP-YFP. (C) Kwantificering van het signaal clusters. 1xYFP en 2xYFP, gratis YFP en translationeel YFP dimeer, respectievelijk. (D) Visualisatie van 1xYFP. (E) Visualisatie van 2xYFP. In microfoto, het linker panelen tonen de YFP-signaal en de juiste panelen tonen samengevoegd beelden van YFP (in groen) en chloroplast autofluorescentie (in wit) signalen. Afbeeldingen zijn enkele confocale secties. Sterretjes in de microfoto tonen de epidermale cellen zien YFP signaal. Bars = 50 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De sleutel voor het succes van de symplastic transport-test is het verkrijgen van een hoge efficiëntie van de omzetting, die de productie van statistisch significante en gemakkelijk waarneembaar signaal clusters mogelijk maakt. Dit kan worden bereikt met behulp van de bladeren geoogst van gezonde, robuuste planten, en het voorbereiden van gouddeeltjes bekleed met een zuivere en geconcentreerde DNA voorbereiding.
Met behulp van de bladeren in dezelfde groeifase is ook van vitaal belang voor de test betrouwbaarheid. Plasmodesmal diafragma is bekend dat het differentieel worden geregeld, afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van het weefsel 7-11. Bladeren van veel plantensoorten ontwikkelen basipetally, van top tot basis, met de apicale deel van het blad zijn meer volwassen dan zijn basale deel 12. Daarom moet niet alleen de ontwikkelingsfase van de bladeren (meestal gereflecteerd door hun grootte en de ligging op de steel) geselecteerd voor elke set van experimenten identiek zijn, maar het blad gebieden het doelwit van microbombardment moeten worden gevestigd op de identieke posities.
Sommige eerdere studies hebben ingezet cel-autonome markers, zoals het endoplasmatisch reticulum-tethered GFP (erGFP) 11, om in eerste instantie getransformeerde cellen dan die waartoe de geteste eiwit heeft verplaatst door symplastic transport onderscheiden. Echter, een latere studie toonde aan dat gelijktijdige weergave van sommige niet-cel-autonome eiwitten met erGFP zou kunnen zijn cel-cel beweging 13 induceren, vraagtekens bij de betrouwbaarheid van de erGFP als eerste transformatie markers en een aanzienlijke verhoging van de moeilijkheid bij de interpretatie van de gegevens uit een dergelijke co-expressie experimenten. Zo geven we de voorkeur om te voorkomen dat de invoering van de expressie van een ander eiwit in onze beweging test, en in plaats daarvan, vertrouwen op statistische analyse van het signaal cluster nummers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Ons werk wordt ondersteund door subsidies van NIH / NIGMS, NSF, USDA / NIFA, en BARD naar VC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | |
| Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | |
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | |
| Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
References
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lucas, W. J. Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes. Virology. 344, 169-184 (2006).
- Epel, B. L. Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases. Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).
- Zambryski, P. C., Crawford, K. Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).
- Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. Growth of plants and presercation of seeds. Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).
- Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat Protoc. 4, 71-77 (2009).
- Oparka, K. J. Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves. Cell. 97, 743-754 (1999).
- Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues. Plant Cell. 11, 309-322 (1999).
- Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices. Development. 126, 1879-1889 (1999).
- Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).
- Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
- Roberts, A. G. Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus. Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).
- Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana. Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).
