Summary
식물 세포 사이 Macromolecular 거래는 transiently 관심 찬란 - 태그 단백질을 표현하고 공촛점 현미경하여 내부와 세포 분포를 분석하여 평가하실 수 있습니다.
Abstract
여기, 우리는 planta에서 휴대 전화의 macromolecular 수송의 범위를 감지하고 평가하는 간단하고 빠른 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜에 관심이 찬란 태그 단백질은 transiently의 인코딩 DNA의 전달 구조 biolistic 다음과 식물 조직에 표시됩니다. 태그 단백질의 내부 및 세포 분포는 다음 공촛점 현미경으로 분석됩니다. 우리는 분석하기 위해 단계별 절차를 제공 세부 사항이 기술을 설명하는 세 식물 종 (种)의 symplastic 단백질 수송의 범위, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana 및 N. 평가 tabacum (담배).
Protocol
배경
식물 세포 연결을 통해 macromolecules의 Symplastic 교통, plasmodesmata는 많은 식물 병리학과 생물학에 관심이 있습니다. 예를 들어, 여러 바이러스 단백질은 바이러스 운동 1-3 있도록 plasmodesmal 크기 제외 한도를 규제하는 것으로 알려져 있습니다. 또한, 그들이 중요한 발달 규제 중 일부 내생 단백질은, 비 셀 자율적으로 4 기능, 아마도 plasmodesmata을 통해 세포에서 세포로 이동 간주됩니다. 따라서 식물 세포 사이의 macromolecular 운송을 파악하고 시각화하는 신뢰할 수있는 방법론이 훨씬 수요에 있습니다.
1) 대상 식물을 성장
높은 변환 효율을위한, 건강, 강력한 식물을 사용해야합니다.
1. Arabidopsis 식물
짧은 photoperiod (130-150 μE m -2 -1의 빛 8 시간 23 °와 환경 제어 챔버의 냄비에 프로 믹스 BX 한 Arabidopsis 공장 (10cm X 10cm X 10cm) 성장 C/16 20 시간 어두운 ° C)과 6~8주 5 40-65% 상대 습도. 5 설명된대로 상용 제품을 종종 그들을 비옥. 15mm X 35mm (길이 측정은 잎자루 포함)보다 큰 크기로 단풍이 실험을 위해 선택됩니다.
2. N. benthamiana와 N. tabacum
긴 photoperiod (23 ° C에서 130-150 μE m -2 -1의 빛을 16 시간과 환경 제어 챔버에 냄비 (20cm X 20cm X 20cm)에 프로 믹스 BX 한 식물을 성장 / 8 20 어두운 HR ° C) 및 7~10주에 대한 40-65% 상대 습도. 묘사와 같은 상용 제품을 종종 그들을 비옥. N. 대한 사이즈 50mm보다 큰 X 70mm와 잎 N. benthamiana에 대한, 또는 100mm X 125mm tabacum가 (이 길이 측정 잎자루에 포함되지 않습니다) 실험 선택됩니다.
DNA - 코팅 골드로 진 건 카트리지 2) 준비 Microparticles
이 실험 단계에 대한 프로토콜은 이전에 여섯 자세히 설명되었습니다. 그것은 높은 농도 (~ 1 μg / μl) 실험의 나중 단계 동안 공촛점 현미경 분석의 용이성을위한 최고의 변환 효율을 얻기 위해에 잘 정화 플라스미드 DNA를 사용하는 것이 매우 중요합니다.
형광 신호 클러스터와 어울리는 세포의 숫자가 symplastic 수송의 범위 (즉,의 지표로 사용되기 때문에 분석을 위해, 그것은 준비 카트리지가 높은 주파수에서 동시에 둘 이상의 인접한 세포를 변형하지 않는 확인할하는 것이 중요합니다 , multicell 신호 클러스터)가 움직임을 나타내는 반면 신호를 포함하는 하나의 조직이 어떤 움직임을 나타냅니다 없습니다. 카트리지 각의 품질은 단백질 16-20시간 포스트 충격의 표현을 분석하여 확인하실 수 있습니다. 우리 프로토콜 6는이 실험 따라서 적당이 시간 프레임에있는 모든 표현 행사 <3 %,에서 multicell 표현 클러스터를 얻을 카트리지를 생산하고 있습니다.
DNA - 코팅 Microparticles 3) Biolistic 배달
- 날카로운 면도날과 같은 발달 단계 (즉, 같은 크기와 같은 나이로, 1 단계를 참조)의 잎을 제거하고 즉시 평면 스티로폼의 표면에까지 직면하고있는 abaxial 측면으로 그들을 놓으십시오. 잎사귀의 abaxial 측면 때문에 그들의 비교적 작은 크기의 Arabidopsis 잎은, 윈도우 화면 메쉬의 조각으로 덮여 있어야합니다. 그 낮은 trichome 밀도와 얇은 표피로 인해 충격을 위해 더 나은 기판을 대표하고, 메쉬 다음 pushpins과 안전 스티로폼 표면 수 있습니다. 유지은 평면은 입자 전달의 효율성을 증가하고 microbombardment 동안 조직에 대한 손상을 최소화 떠납니다.
- 총으로 DNA - 코팅 microparticles (1 단계에서 준비)와 카트리지를 삽입합니다. Arabidopsis 들어, 촬영은 0.6 - μm의의 microparticles 1 - μm의 microparticles, 그리고 140-160 PSI에 대한 80-110 PSI의 압력에서 수행됩니다. N. 들어 benthamiana 담배는 촬영은 0.6 - μm의 microparticles 1 - μm의 microparticles, 그리고 160-180 PSI에 대한 PSI의 압력 100-120에서 수행됩니다. 각 잎은 직경 10-12mm의 영역 microparticles을 확산 한방에 충분한 면적을 가지고 있기 때문에 Arabidopsis 위해, 우리는 일반적으로 잎 당 하나의 카트리지를 사용합니다. 큰 N.으로 benthamiana와 담배 잎 같은 잎의 여러 bombardments은 가능하지만, 그들은 (토론 참조) 같은 발달 단계에서 잎 영역을 대상으로 중간 리브의 양쪽에 대칭 위치에서 수행되어야합니다.
- 스티로폼 표면에서 잎을 제거하고 그들에게 내가 배치서부 유럽 표준시 왓먼 필터 종이 3 레이어가 아닌 페트리 접시는 Parafilm와 페트리 접시를 밀봉하고, 그들의 단백질 제품의 배달 transgenes와 휴대 전화의 운동 잠재력의 표현을 허용하기 위해 36-48 시간을위한 실내 온도에서 품어 .
단백질의 표현 4) 영상
transiently 표현 태그 단백질의 형광 신호는 공촛점 현미경에 의해 시각입니다. 치료는 각 테스트 단백질의 검출을위한 최적의 현미경 설정을 찾을로 이동해야합니다. 예를 들어, 담배 모자이크 바이러스 운동 단백질 (TMV MP) 1-3,6의 plasmodesmal 지방화로 약한 신호 강도와 제한 세포내 축적을 보여 단백질은 높은 해상도와를 내실수 40X 객관적인 렌즈, 아래의 관찰해야합니다 감도는 반면, 같은 무료 YFP와 같은 강력한 신호 농도, 세포질과 유통을 보여 단백질 빠른 영상에 대한 공촛점 줌 기능이있는 객관적인 10X 렌즈 (그림 1 참조)에서 시각하실 수 있습니다.
Symplastic 수송은 형광 신호를 포함하는 multicell 클러스터의 모양에서 유추됩니다. 각 클러스터의 클러스터와 같은 세포의 수를는 휴대 전화 전송의 범위 나타내는 것입니다. 신뢰할 수있는 데이터를 얻으려면, 최소한 100 표현 클러스터는 각 실험 시스템마다 기록해야합니다. 예를 들어, 단백질의 휴대 전화의 움직임이 총 200 표현 클러스터의 두 가지 다른 유전 배경 (예, 야생 종류와 유전자 변형 식물)에 비교하면이 기록되어야합니다. 중요한 것은, 실험, 서로 비교해야하는 결과가 동시에 진행되어야합니다.
5. 대표 결과
아래의 그림은 찬란 태그 단백질의 symplastic 교통 검출을위한 대표적인 실험을 보여줍니다. 패널은 A와 B는 N.의 다음 microbombardment를 획득하는 전형적인 공촛점 이미지를 표시 TMV MP - YFP - 표현과 benthamiana 리프가 건설. 패널에서 TMV MP - YFP의 A, symplastic 운동은 YFP 신호의 multicell 클러스터의 모양에 따라 관찰합니다. 모든 transiently 표현 TMV MP - YFP은 일부 microbombardments (패널 B)의 단일 세포 신호에 의해 입증 이동시킬 수 없습니다. 통계에 <계산 신호 클러스터의 40 %, TMV MP - YFP는 반면, 세포 사이를 이동할 수없는>의 클러스터의 60 %, 단백질은 두 세포 확산이 가장 자주 있기 때문에 2-5 셀 사이를 이동 (ca. ~ 50 % 가지 경우) (그림 1C).
타고난 운동 활동을하지 않고 비교적 작은 분자 크기의 단백질은 휴대 전화를 이동하는 PD를 통해 확산하실 수 있습니다. 예를 들어, 무료 YFP, 또는 1xYFP은 (ca. 27 KDA, 패널 D), 계산 클러스터 (패널 C)의 30 %가 여러 세포 사이에 확산됩니다. 이 이외의 특정 확산은 TMV MP - YFP 융합 단백질 (57 KDA)의 크기 비교이며, 완전히 셀 자치있는 translational YFP의 주차 또는 2xYFP (54 KDA, 패널 E)에 대한 발생하지 않습니다 (그림 1C).
N.의 symplastic 교통 분석에서 얻은 그림 1. 전형 결과 benthamiana 잎 조직. TMV MP - YFP의 (A, B) 시각. 신호 클러스터 (C) Quantitation. 1xYFP 및 2xYFP, 무료 YFP 각각 translational YFP 이합체. 1xYFP의 (D) 시각. 2xYFP의 (E) 시각. micrographs에서, 왼쪽 패널 YFP 신호를 표시하고 오른쪽 패널 합병 YFP의 이미지 (녹색) 및 엽록체의 autofluorescence (흰색) 신호를 보여줍니다. 이미지는 단일 공촛점 섹션입니다. micrographs에 별표 YFP 신호를 보여주는 표피 세포를 보여줍니다. 바 = 50 μm의.
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Discussion
symplastic 교통 분석의 성공에 대한 열쇠는 통계적으로 중요한 쉽게 detectible 신호 클러스터의 생산을 허용 높은 변환 효율을 얻을 수 있습니다. 이것은 건강, 강력한 식물에서 수확한 잎을 사용하고 순수하고 집중 DNA 준비로 코팅된 금 입자를 준비 얻을 수 있습니다.
같은 성장 단계에서 나뭇잎을 사용하면 분석의 신뢰성을 위해 매우 중요합니다. Plasmodesmal 조리개는 differentially 조직 7-11의 발달 단계에 따라 규제 것으로 알려져있다. 많은 식물의 종류 단풍의 기초 12 부보다 더 성숙되고있는 잎의 꼭대기의 일부로, 꼭대기에서 기지로 basipetally 개발할 수 있습니다. 따라서, 실험의 각 집합에 대해 선택한 단풍 (보통 자신의 크기와 줄기에 위치하여 반영)의 발달 단계뿐만 아니라 동일해야하지만, microbombardment 대상 잎 영역은 동일한 위치에 위치해야합니다.
일부 이전 연구는 endoplasmic reticulum - 닿는 GFP (erGFP) 11 등 셀 자치 마커를 사용한 테스트 단백질 symplastic 교통 이동 가지고있는 이러한 변화의 초기 세포를 구별합니다. 그러나, 나중에 연구 erGFP와 함께 일부가 아닌 셀 - 자율적인 단백질의 동시 표현이 초기 변환 마커로 erGFP의 신뢰성에 의문을 제기, 그 휴대 전화의 움직임 13 유도하고 실질적에서 데이터의 해석에 어려움을 증가 수 보여주 이러한 coexpression 실험. 따라서, 우리 운동 분석에 다른 단백질의 표정을 도입하지 않도록하는 것을 선호하고, 대신, 신호 클러스터 번호를 통계 분석에 의존하고 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리 작품은 VC에 NIH / NIGMS, NSF, USDA / NIFA 및 바드에서 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | |
| Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | |
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | |
| Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
References
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