Summary
Bitki hücreleri arasındaki makromoleküler ticareti, geçici bir ilgi floresan etiketli protein ifade ve konfokal mikroskobu ile içi ve hücreler arası dağılımı analiz değerlendirilebilir.
Abstract
Burada, planta içinde hücre-hücre makromoleküler taşıma kapsamını tespit etmek ve değerlendirmek için basit ve hızlı bir protokol mevcut. Bu protokol, geçici bir ilgi floresan etiketli protein kodlama DNA Biyolistik teslim inşa aşağıdaki bitki doku ifade edilir. Etiketli protein içi ve hücreler arası dağılımı sonra konfokal mikroskobu ile analiz edilir. Biz detaylı olarak tahlil için adım adım protokoller sağlayarak, bu teknoloji tanımlayan ve üç bitki türlerinin symplastic protein taşıma ölçüde, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana ve N. değerlendirmek tabacum (tütün).
Protocol
Arkaplan
Bitki hücrelerarası bağlantıları aracılığıyla makromoleküllerin Symplastic ulaşım, plasmodesmata, birçok bitki patologlar ve biyologlar ilgi. Örneğin, bazı viral proteinler, viral hareketi 1-3 etkinleştirmek için plasmodesmal boyut dışlama sınırlarını düzenlemek için bilinmektedir . Ayrıca, önemli gelişim düzenleyiciler arasında bazı endojen proteinler, 4-hücreli olmayan-özerk çalışması için, muhtemelen plasmodesmata aracılığıyla hücreden hücreye geçmek için varsayılır. Bu nedenle, bitki hücreleri arasındaki makromoleküler taşımacılığı tanımlamak ve görselleştirmek için güvenilir bir yöntem çok talep.
1) Hedef bitkiler büyümek
Dönüşüm verimliliği yüksek, sağlıklı, sağlam bitkiler kullanılmalıdır.
1. Arabidopsis bitkiler
Çevre kontrollü bir odasında kısa bir fotoperiyodun (130-150 μE m -2 s -1 ışık 8 saat 23 ° Grow bir tencerede Pro-Mix BX bir Arabidopsis bitkisi (10 cm x 10 cm x 10 cm ) C/16 saat karanlık 20 ° C) ve 6 ila 8 hafta 5 için% 40-65 bağıl nem. 5 açıklandığı gibi piyasada bulunan ürünleri ile zaman zaman onları Gübreleme . 15 mm x 35 mm (uzunluk ölçümü sapı dahil olmak üzere) daha büyük boyutu ile Yapraklar deneyler için seçilir.
2. N. benthamiana ve N. tabacum
Pro-Mix BX bir bitki yetiştirmek uzun bir fotoperiyodun (23 ° C'de 16 saat 130-150 μE m -2 s -1 ışık çevre kontrollü bir odasında bir pot (20 cm x 20 cm x 20 cm ) / 8 karanlık saat 20 ° C) ve 7 ila 10 hafta boyunca% 40-65 bağıl nem. Tarif olarak piyasada bulunan ürünleri ile zaman zaman onları gübreleyin. N. boyutu 50 mm daha büyük x 70 mm ile yaprak N. benthamiana, ya da 100 mm x 125 mm tabacum (bu uzunluk ölçümleri sapı dahil değildir) deneyler için seçilir.
2), DNA-kaplı Altın Gen Tabancası Kartuşu Hazırlık Mikroküreler
Bu deneysel bir adım için protokol daha önce 6 ayrıntılı olarak tarif edilmiştir . Yüksek konsantrasyonlarda (~ 1 mcg / ml) Deneyin sonraki aşamalarında konfokal mikroskopi analiz kolaylığı açısından en yüksek dönüşüm verimi elde etmek için iyi arıtılmış plazmid DNA kullanımı çok önemlidir.
Bu testte için, floresan sinyal kümesi ile ilişkilendirerek hücrelerinin sayıları symplastic taşıma ölçüde (yani bir göstergesi olarak kullanılması nedeniyle, hazırlanan kartuş, yüksek frekansta aynı anda iki veya daha fazla bitişik hücre dönüşümü yaptığı tespit etmek önemlidir. , çok hücreli sinyal kümesi) hareketi gösterir iken sinyal içeren tek bir hücre, herhangi bir hareketi gösterir. Her bir kartuş kaliteli protein 16-20 saat bombardımanı ifade analiz ederek kontrol edilebilir. Bizim protokol 6 sadece böylece bu deney için uygun olan bu zaman dilimi içinde bütün ifade olaylar <% 3, çok hücreli ifade kümeleri kapasiteli kartuşlar üretir .
3) DNA kaplı Mikroküreler Biyolistik Teslimat
- Keskin bir jilet ile aynı gelişim aşamasında (yani aynı boyutta ve aynı yaş, adım 1) yaprakları çıkarın ve hemen eksen dışı tarafı yukarı bakacak şekilde, düz bir strafor yüzeye koyun. Yaprak eksen dışı tarafında nispeten küçük boyutu nedeniyle Arabidopsis yaprakları, pencere perde mesh bir parça ile kaplanmış olmalıdır. Alt trikom yoğunluğu ve ince kütikül nedeniyle bombardımanı için daha iyi bir substrat temsil eder ve sonra mesh pushpins ile güvence strafor yüzey. Bakımı düz parçacık teslim verimliliği artırır ve microbombardment sırasında doku hasarı en aza indirir bırakır.
- Tabanca içine DNA kaplı mikro (adım 1 hazırlanan) kartuşu takın. Arabidopsis, çekim, 0.6 mikron mikro 1 mikron mikro ve 140-160 psi için 80-110 psi basınçta yapılır . N. benthamiana ve tütün 0.6 mikron mikro için, çekim 1 mikron mikro ve 160-180 psi 100-120 psi basınçta yapılır. Arabidopsis için her yaprak sadece bir atış mikro 10-12 mm çapında bir alana yayılır için yeterli yüzey alanına sahip olduğundan, genellikle, yaprak başına tek bir kartuş kullanmaktadır. Büyük N. ile benthamiana ve tütün yaprakları, aynı yaprak birden fazla bombardımanları mümkündür, ancak, onlar (Tartışma), aynı gelişimsel aşamada yaprak alanları hedef orta kaburga her iki tarafta simetrik pozisyonlarda yapılması gerekir .
- Strafor yüzey yaprakları çıkarın ve onları i yerdeıslak Whatman filtre kağıdı 3 kat üzerinde bir Petri kabı, Parafilm Petri kabı mühür ve protein ürünleri teslim transgenlerin ve hücre-hücre hareketi potansiyel ifade izin oda sıcaklığında 36-48 saat süreyle inkübe .
4) Görüntüleme Protein Ekspresyonu
Geçici olarak ifade etiketli proteinlerin floresan sinyal konfokal mikroskobu ile görüntülenmiştir. Bakım her test protein tespiti için en uygun mikroskopi ayarları bulmak için alınmalıdır. Örneğin, proteinler, Tütün mozaik virüsü hareket protein (TMV MP) 1-3,6 plasmodesmal yerelleştirme gibi zayıf sinyal intensitesi ile sınırlı intrasellüler birikimi, yüksek çözünürlük ve tanıyor 40X objektif lens altında gözlenen olmalıdır hassasiyet, oysa ücretsiz YFP gibi güçlü bir sinyal yoğunlukları, sitoplazmik dağılım gösterir proteinler daha hızlı görüntüleme için konfokal zoom fonksiyonu ile 10X objektif lens (bkz. Şekil 1) altında görüntülenmiştir olabilir.
Symplastic ulaşım, floresan sinyal içeren çok hücreli kümeleri görünümünü anlaşılmaktadır. Her küme, kümeler ve hücrelerin sayısı sayısı, hücre-hücre taşıma ölçüde göstergesidir. Güvenilir veri elde etmek için, her bir deneysel sistem başına en az 100 ekspresyonu kümeleri kayıt altına alınmalıdır. Örneğin, bir proteinin hücre-hücre hareketi toplam 200 ifade kümeleri iki farklı genetik geçmişleri (örneğin, vahşi tip ve transgenik bitkiler), karşılaştırıldığında ise kayıt altına alınmalıdır. Önemlisi, deneyler,, birbirlerine göre hangi sonuçları eşzamanlı olarak yürütülen olmalıdır.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Aşağıdaki şekil, floresan etiketli proteinlerin symplastic ulaşım tespiti için temsili deneyler göstermektedir. Paneller A ve B bir N. aşağıdaki microbombardment elde edilen tipik konfokal resimleri gösterir. TMV MP-YFP-ifade benthamiana yaprak oluşturun. Panelinde TMV MP-YFP symplastic hareket YFP sinyal çok hücreli kümeleri görünümünü dayalı görülmektedir. Tüm geçici olarak ifade TMV MP-YFP bazı microbombardments (panel B) tek hücreli sinyal kanıtladığı gibi hareket etmek mümkün değildir. İstatistiksel olarak, içinde <% 40 sayılır sinyal kümeleri, TMV MP-YFP ise hücreler arasında hareket edemez> kümelerin% 60, protein, iki hücre yayılmasını en sık olmak üzere, 2-5 hücreler arasında hareket eder (yaklaşık ~ 50 Olguların%) (Şekil 1C).
Doğuştan hareket aktivite olmadan, nispeten küçük moleküler boyutu ile proteinlerin hücre-hücre taşımak için PD yoluyla diffüz. Örneğin, ücretsiz YFP veya 1xYFP (yaklaşık 27 kDa, panel D) sayılır kümeleri (panel C)% 30 çeşitli hücreler arasında yayılır. Bu non-spesifik difüzyon TMV MP-YFP füzyon proteini (57 kDa) boyutu karşılaştırılabilir ve tamamen hücre özerk olduğu bir translasyonel YFP sönük veya 2xYFP (54 kDa, panel E) oluşmaz (Şekil 1C).
N. symplastic taşıma testte elde edilen Şekil 1. Tipik sonuçlar benthamiana yaprak dokuları. (A, B) Görselleştirme TMV MP-YFP. (C) sinyal kümeleri kantitasyonu. 1xYFP ve 2xYFP, ücretsiz YFP ve sırasıyla translasyonel YFP dimer. (D) 1xYFP Görselleştirme. (E) 2xYFP Görselleştirme. Mikrograflar, sol paneller YFP sinyal göstermiyor ve sağ panelleri birleştirilmiş YFP görüntüleri (yeşil) ve kloroplast otofloresans (beyaz) sinyalleri gösteriyor. Görüntüler tek konfokal bölümleridir. Mikrograflar Asteriskler YFP sinyali gösteren epidermal hücreler göstermektedir. Barlar = 50 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Symplastic taşıma testinin başarı için anahtar, yüksek dönüşüm verimliliği, istatistiksel olarak anlamlı ve kolayca detectible sinyal kümeleri üretimini sağlar elde etmektir. Bu, sağlıklı, sağlam bitkiler hasat yapraklar kullanılarak, saf ve yoğun bir DNA hazırlığı ile kaplı altın parçacıkları hazırlanması sağlanabilir.
Aynı büyüme aşamasında yaprakları kullanarak da testin güvenilirliği için hayati önem taşımaktadır. Plasmodesmal diyafram farklı doku 7-11 gelişim aşamasına bağlı olarak, düzenlendiği bilinmektedir. Pek çok bitki türünün yaprakları, bazal kısım 12 daha olgun olan yaprak apikal kısmı ile, apeks tabanına basipetally gelişir. Böylece, her deney için seçilen yaprakları (genellikle kök boyutu ve konumu ile yansıtılır) gelişimsel aşamada sadece aynı olmalıdır, ancak microbombardment tarafından hedef yaprak alanları aynı pozisyonlarda yer almalıdır.
Bazı eski çalışmalarda hücre özerk belirteçleri, endoplazmik retikulum gergin GFP (erGFP) 11, istihdam test protein symplastic taşıma ile hareket ettiği, başlangıçta dönüştürülmüş hücreleri ayırt etmek için. Ancak, daha sonraki bir çalışmada erGFP hücre özerk olmayan bazı proteinlerin eşzamanlı ifade ilk dönüşüm belirteçleri olarak erGFP güvenilirliğini sorgulayan, hücre-hücre hareketi 13 neden ve verilerin yorumlanması zorluk önemli ölçüde artan gösterdi Koekspresyon deneyler gibi. Bu yüzden, bizim hareket tahlil başka bir protein ifade almaktan kaçınması tercih ve yerine, sinyal küme numaraları istatistiksel analiz güveniyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bizim işimiz, VC NIH / NIGMS, NSF, USDA / NIFA ve BARD hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | |
| Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | |
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | |
| Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
References
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lucas, W. J. Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes. Virology. 344, 169-184 (2006).
- Epel, B. L. Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases. Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).
- Zambryski, P. C., Crawford, K. Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).
- Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. Growth of plants and presercation of seeds. Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).
- Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat Protoc. 4, 71-77 (2009).
- Oparka, K. J. Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves. Cell. 97, 743-754 (1999).
- Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues. Plant Cell. 11, 309-322 (1999).
- Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices. Development. 126, 1879-1889 (1999).
- Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).
- Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
- Roberts, A. G. Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus. Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).
- Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana. Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).
