Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

doi: 10.3791/2209 Published: September 11, 2010

Summary

في هذا الفيديو ، سوف نقوم شرح كيفية عزل الخلايا الجذعية من الظهارة الشبكية الهدبية للعين الماوس وتنمو لهم في مجالات الثقافة لتشكيل نسيلي الشبكية. المجالات التي يتم عزل تمتلك خصائص أساسية للخلايا الجذعية : الذات وتجديد multipotentiality.

Abstract

الكبار الخلايا الجذعية الشبكية (RSC) هي الخلية النادرة هادئة وجدت داخل ظهارة الهدبية (م) من العين الثدييات 1،2،3. وأدلى م حتى من غير ذوي البشرة الداخلية وطبقات الخلايا الصباغية الخارجي ، ومصنوعة المستعمرات نسيلي RSC التي تنشأ من خلية واحدة من المصطبغة CE يصل كل من الخلايا الصباغية وغير الصباغية ، والتي يمكن أن تكون متمايزة لتشكيل جميع أنواع الخلايا العصبية للشبكية وRPE لل. هناك بعض الجدل حول ما اذا كانت جميع الخلايا ضمن مجالات تحتوي على كل ما لا يقل عن بعض الصباغ 4 ، ولكن الخلايا لا تزال قادرة على تشكيل أنواع مختلفة من الخلايا الموجودة داخل الشبكية العصبية 1-3. في بعض الأنواع ، مثل البرمائيات والأسماك ، وعيونهم قادرة على التجدد بعد إصابة 5 ، ولكن ؛ العين الثدييات لا تظهر هذه الخصائص على التجدد. نحن نسعى للتعرف على الخلايا الجذعية في الجسم الحي وفهم الآليات التي تبقي الخلايا الجذعية الثديية هادئة شبكية العين 6-8 ، وحتى بعد الاصابة فضلا عن استخدامها كمصدر محتمل للخلايا للمساعدة في إصلاح نماذج الجسدية أو الوراثية للإصابة العين من خلال زرع 12/09. نحن هنا تصف كيفية عزل الخلايا الظهارية الهدبية من العين الفأر وتنمو بها في الثقافة من أجل تشكيل الخلايا الجذعية نسيلي الشبكية المجالات. حيث لا توجد علامات معروفة من الخلايا الجذعية في الجسم الحي ، وهذه المجالات هي الطريقة الوحيدة المعروفة لتحديد مستقبلي السكان الخلايا الجذعية داخل ظهارة الهدبي للعين.

Protocol

1. إعداد حلول تشريح وحلول أنزيم

  1. جعل السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي (ACSF) وسائل الاعلام المصل خالية في وقت سابق والثلاجة.
  2. تزن خارج حمض Kynurenic (0.2 ملغ / مل) ، وتذوب في 10 مل من ACSF هيلو في بالحمام المائي 37 درجة مئوية في وقت مبكر لأنها لا تذوب بسهولة.
  3. تزن خارج التربسين (1.33 ملغ / مل) وهيالورونيداز (0.67 ملغ / مل) ووضعه في أنبوب واحد 15 مليلتر وابقائه في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. إضافة محلول حمض Kynurenic لهذا الأنبوب والتصفية باستخدام حقنة 22 ميكرون فلتر فقط قبل استخدامه.
  4. تزن خارج التربسين المانع (Ovamucoid : 1 ملغ / مل) ، وتذوب في وسائل الإعلام المصل خالية من الدفء والتصفية باستخدام محقنة 22μm التصفية.
  5. جعل وسائل الإعلام الطلاء : مصل خالية تحتوي على وسائل الإعلام FGF2 (10 نانوغرام / مل) والهيبارين (2 ميكروغرام / مل).

2. عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

  1. يتم تنفيذ عزل الخلايا الجذعية الشبكية في غرفة معقمة محددة مكرسة لثقافة التجارب الأولية. قبل البدء في هذا الإجراء ، وإعداد مجهر تشريح ومصدر ضوء الباردة ، ومن ثم وضع الأدوات المعقمة تشريح. كل غطاء لديه معقم الساخنة حبة لتعقيم الأدوات بين الخطوات.
  2. سنقوم عزل الخلايا الجذعية من أعين الشبكية التي تم وضعها على الفور في طبق بتري معقمة تحتوي على السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي (ACSF) بعد إزالتها من الفئران التضحية الحيوانية وافق وفقا لأخلاقيات البروتوكولات.
  3. تشريح تحت المجهر ، وتنظيف العين مع ملقط : تخلص من الشعر والنسيج الضام الذي تعلق على القرنية / الحدود الصلبة. ثم نقل العين إلى صحن جديد مع ACSF.
  4. بينما يمسك بلطف على العين ثابت مع ملقط مسنن ، واستخدام الزاوية الصغيرة تشريح المقص لإزالة عضلات العين. إزالة العصب البصري وكذلك إذا كان لا تزال تعلق على العين. ليس محاولة لإسحق العين أثناء هذه العملية. نقل عينيه على طبق جديد مع ACSF.
  5. استخدام المقبل منحني الدقيقة تشريح مقص لقطع في نصف العين : تبدأ في العصب البصري وقطع طريق وسط القرنية ، الاجتماع مرة أخرى في العصب البصري حيث بدأ الخفض. وهو مثالي إذا قطعتين من العين هي ما يعادل تقريبا في الحجم لأن ذلك سوف يجعل الخطوة التالية أسهل.
  6. عقد القرنيات باستخدام اثنين من الملقط ، بلطف قشر العين نصفين منفصلين. إزالة والتخلص من العدسة ، والأحشاء ، والعصبية للشبكية العين من القذائف. نقل القذائف على طبق جديد مع ACSF.
  7. الآن نحن على استعداد لعزل ظهارة الهدبية. لتبدأ ، توجيه قذيفة العين بحيث القرنية على يمينك والشبكية الصباغي الطلائية (RPE) هو على اليسار. دبوس برفق قذيفة أسفل العين مع ملقط على التوالي على الجانب RPE.
  8. المقبل ، واستخدام مشرط لقطع القرنية والقزحية بعيدا عن ظهارة الهدبية للعين عن طريق دفع برفق لأسفل على مشرط بدلا من استخدام الاقتراحات النشر.
  9. بعد ذلك ، قص ظهارة الهدبية بعيدا عن RPE. عدم استخدام ملقط مسنن لنقل شريط من ظهارة الهدبية إلى صحن 35 ملم جديدة تحتوي على ACSF.
  10. في نفس الطريق ، وعزل ظهارة الهدبية من قذيفة العين الأخرى.
  11. مرة واحدة جمعت كل من شرائط الهدبية الظهارية ، ونقل الشرائط الى صحن 35 ملم تحتوي على 2 مل من Dispase. مكان الطبق مع شرائح في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  12. بعد 10 دقيقة ، ونقل شرائح من Dispase في صحن يحتوي على 2 مل من التربسين تصفيتها ، هيالورونيداز وحمض Kynurenic. ضع طبق في 37 لمدة 10 دقائق درجة مئوية.
  13. الآن نعود إلى مجهر تشريح. في حين عقد الصلبة إلى أسفل مع ملقط على التوالي ، واستخدام الجزء السفلي من ملقط مسنن غير منحنية لكشط البشرة بلطف الهدبية بعيدا عن الصلبة.
  14. إزالة الصلبة من الطبق. كل ذلك ينبغي أن يترك في الطبق الآن هي الخلايا من الاهتمام والحل الانزيم.
  15. باستخدام ماصة القطن توصيل النار مصقول ، ونقل هذا الحل في أنبوب 14 مل. متمزج هذا الحل 30 مرات لتحطيم الخلايا الظهارية من خلال إجبار برفق في حل والخروج من ماصة.
  16. أنبوب الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1500 دورة في الدقيقة. عندما يتم الطرد المركزي ، وإزالة أنبوب من أجهزة الطرد المركزي منذ بعناية الخلايا المعرضة للنزوله أسفل الأنبوب في هذه المرحلة.
  17. نضح بلطف غالبية طاف به ماصة مصقول النار ، ثم إضافة 1 مل من مثبط التربسين في المصل خالية من وسائل الإعلام إلى الخلايا. استخدام القطن بئر صغيرة ماصة لتوصيل متمزج العينة ما يقرب من 50 مرات حتى يتم تعليق وحيد الخلية.
  18. أنبوب الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق عند 1500 دورة في الدقيقة.
  19. إزالة طاف واستبدالها مع 1 مل من المتوسط ​​الطلاء الخاص. متمزج بلطف باستخدام ماصة الزجاج المصقول إلى النار resuspend الخلايا.
  20. بعد العدجي الخلايا ، لوحة لهم في الكثافة المطلوبة في صفيحة ال 24 أيضا. نحن لوحة عادة 10 خلية / ميكرولتر من خلال تعبئة كل أول بئر مع المتوسط ​​ثم إضافة تعليق خلية للحصول على الحجم النهائي من 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام.
  21. وضع لوحة في الحاضنة 37 2 درجة مئوية ثاني حيث أنه لن يتم نقل حتى كنت تعول المجالات التي تنشأ بعد 7 أيام.

3. نتائج عزل الخلايا الجذعية الشبكية

  1. عندما يتم تنفيذ هذا الإجراء بنجاح ، يجب أن تشريح الخلايا الظهارية الهدبية تبدو هذه بعد فصلها ومطلي في كثافة منخفضة (الشكل 1).
  2. بعد 7 أيام في الثقافة ، ويتم الاعتماد على الخلايا الجذعية الشبكية المجالات التي تنشأ. وينبغي أن يكون المجال أكثر من 75 ميكرومتر في القطر والتعويم الحر لتحسب بوصفها مجال الخلايا الجذعية المشتقة. (الشكل 2). ومع ذلك ، فإن بعض الخلايا محدودة الانتشار وشكل الأجسام الشبه الكروية التي لا تستوفي معيار حجم وسوف لا تكون محسوبة على مجالات الخلايا الجذعية المشتقة ؛ يظهر مثال كروي من هذا القبيل هنا (الشكل 2).

4. ممثل النتائج

الشكل 1
الشكل 1.

الشكل 2
الشكل 2.

Discussion

هذا البروتوكول توضح كيفية عزل الخلايا الجذعية من الظهارة الشبكية الهدبية من الفأرة 1-3 العين. يمكن للمنهجية لعزل شرائط من ظهارة الهدبية تختلف ، ومع ذلك فقد تم تحسين الانزيمات ومنهجية لتحقيق تعليق وحيد الخلية في هذا البروتوكول. من المهم أيضا أن يجرد من ظهارة الهدبية التي تم عزلها لا تحتوي على كميات كبيرة من RPE أو القرنية منذ هذه تظهر أن يكون لها أثر سلبي على إجمالي عدد من المجالات التي يمكن أن تكون معزولة عن كل عين. بالإضافة إلى ذلك ، وسائل الاعلام المصل الحرة التي نتخذها التي صيغت في الأصل لneurospheres الدماغ 13 ، مثالية لزراعة الخلايا الجذعية الشبكية المجالات. ينبغي للمرء أيضا التأكد من أن ليست منزعجة من الخلايا بعد أن تم مطلي انهم وضعت في الحاضنة بحيث مجالات النمو لا التجميعية معا 14.

مرة واحدة في الخلايا الجذعية في شبكية العين قد شكلت نسيلي المجالات ، ويمكن عدهم على الحصول على عدد من الخلايا الجذعية المحتملين في العين. المجالات ومن ثم يمكن بعد ذلك فصل واحد والى خلايا passaged لقدرات ذاتية التحقق تجديد أو متمايزة الى أنواع مختلفة من الخلايا العصبية للشبكية وRPE باستخدام تركيبات مختلفة من عوامل النمو و / أو البروتينات.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر لورا كلارك لتقديم المساعدة لها لا تقدر بثمن. ويدعم هذا العمل NCE : الجذعية شبكة الخليوي ، والمعاهد الوطنية للصحة CIHR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stemi 2000 Microscope Carl Zeiss, Inc.
Cold Light Source Carl Zeiss, Inc. KL1500 dual arm optic light
Curved Mini Vannas scissors Fine Science Tools 15000-10
Angled Vannas scissors Fine Science Tools 15005-08
#7 Dumont forceps Fine Science Tools 11272-30 non-serrated
#5 Dumont forceps Fine Science Tools 11251-10 straight
Fine forceps Fine Science Tools 11051-10 serrated curved
#3 Scalpel handle Almedic 2586-M36-10
#10 Scalpel blades Almedic 2580-M90-10
Hot Bead Sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Dispase VWR international CACB354235
Trypsin Sigma-Aldrich T1005
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H6254
Kynurenic Acid Sigma-Aldrich K3375 1000 IU
Trypsin Inhibitor Roche Group 10109878001
35 mm dishes VWR international CA354235
24-well plate VWR international CA73521-004
Cotton-plugged pipettes VWR international 14672-400 fire-polish
14 mL Tubes Falcon BD 352057 Polystyrene
Serum-free Media Ref# 13 for formulation
FGF2 Sigma-Aldrich F0291
Heparin Sigma-Aldrich H3149 100 IU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. Retinal stem cells in the adult mammalian eye. Science. 287, 2032-2036 (2000).
  2. Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye. Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).
  3. Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).
  4. Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).
  5. Lamba, D., Karl, M., Reh, T. Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye. Cell Stem Cell. 2, (6), 538-549 (2008).
  6. Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo. Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).
  7. Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro. Stem Cells. 24, (3), 696-706 (2006).
  8. Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6. Dev Biol. 304, 713-721 (2007).
  9. Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, (1), 446-4454 (2007).
  10. Canola, K., Arsenijevic, Y. Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation. Neuroreport. 18, (9), 851-855 (2007).
  11. Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation. Cell Tissue Res. 331, (1), 347-357 (2008).
  12. Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells. Stem Cells. 28, (3), 489-500 (2010).
  13. Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol. 208-201 (1999).
  14. Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, (11), 2938-2944 (2008).
عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coles, B. L., van der Kooy, D. Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye. J. Vis. Exp. (43), e2209, doi:10.3791/2209 (2010).More

Coles, B. L., van der Kooy, D. Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye. J. Vis. Exp. (43), e2209, doi:10.3791/2209 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter