Summary
इस वीडियो में, हम प्रदर्शन करेंगे कैसे माउस आँख के सिलिअरी उपकला से रेटिना स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए और उन्हें संस्कृति में विकसित करने के लिए clonal रेटिना क्षेत्रों फार्म. क्षेत्रों है कि अलग कर रहे हैं, स्टेम कोशिकाओं के कार्डिनल गुणों के अधिकारी: आत्म नवीकरण और multipotentiality.
Abstract
वयस्क माउस रेटिना स्टेम सेल (RSC) एक दुर्लभ मौन स्तनधारी 1,2,3 आँख के सिलिअरी उपकला (CE) के भीतर पाया सेल है . CE, गैर pigmented भीतर और pigmented बाहरी सेल परतों के ऊपर बना है, और clonal RSC कालोनियों कि CE से एक pigmented सेल से उत्पन्न दोनों pigmented और गैर pigmented कोशिकाओं जो विभेदित किया जा सकता है से बना रहे हैं के लिए सभी फार्म तंत्रिका रेटिना और RPE की कोशिका प्रकार. वहाँ कि सभी क्षेत्रों के भीतर कोशिकाओं सब कुछ कम से कम 4 वर्णक होते हैं के बारे में कुछ विवाद है, लेकिन कोशिकाओं को अभी भी अलग सेल प्रकार तंत्रिका 1-3 रेटिना के भीतर पाया बनाने में सक्षम हैं. कुछ प्रजातियां, amphibians और मछली जैसे, उनकी आँखों में 5 की चोट के बाद उत्थान के लिए सक्षम हैं, तथापि, स्तनधारी आंख ऐसी कोई पुनर्योजी गुण से पता चलता है. हम vivo में स्टेम सेल की पहचान और तंत्र है कि स्तनधारी रेटिना स्टेम कोशिकाओं 6-8 मौन रखने को समझने की चोट के बाद भी रूप में अच्छी तरह के रूप में कोशिकाओं का एक संभावित स्रोत के रूप में उन्हें का उपयोग करने के लिए आँख की चोट की मरम्मत शारीरिक या आनुवंशिक मॉडल की मदद की तलाश के माध्यम से 9-12 प्रत्यारोपण. यहाँ हम का वर्णन कैसे माउस आंख से सिलिअरी उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए और उन्हें संस्कृति में बढ़ने के क्रम में clonal रेटिना स्टेम सेल क्षेत्रों के रूप में. के बाद से वहाँ vivo में स्टेम सेल का कोई ज्ञात मार्करों हैं, इन क्षेत्रों को ही जाना जाता भावी आँख के सिलिअरी उपकला भीतर स्टेम सेल की आबादी की पहचान कर रहे हैं.
Protocol
1. विदारक समाधान और एनजाइम समाधान तैयार
- कृत्रिम सेरेब्रल स्पाइनल द्रव (ACSF) और सीरम मुक्त समय से आगे मीडिया बनाओ और सर्द.
- Kynurenic एसिड (0.2 मिलीग्राम / एमएल) वजन और एक 37 डिग्री सेल्सियस waterbath में Hilo ACSF के 10 एमएल में समय से आगे भंग के बाद से यह आसानी से भंग नहीं करता.
- (1.33 मिलीग्राम / एमएल) trypsin और hyaluronidase (0.67 मिलीग्राम / एमएल) और एक 15 एमएल ट्यूब में जगह वजन और यह -20 डिग्री सेल्सियस पर रखना जब तक जरूरत है. इस ट्यूब में Kynurenic एसिड समाधान जोड़ें और एक 22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर ठीक पहले का उपयोग कर का उपयोग करने के लिए फिल्टर.
- Trypsin अवरोध करनेवाला (Ovamucoid: 1 मिलीग्राम / एमएल) का वजन और गर्म सीरम मुक्त मीडिया और 22μm सिरिंज फिल्टर फिल्टर का उपयोग में भंग.
- मीडिया चढ़ाना सीरम मुक्त FGF2 (10 एनजी / एमएल) और (2 μg / एमएल) हेपरिन युक्त मीडिया: बनाओ.
2. माउस आँखों से रेटिना स्टेम सेल को अलग
- रेटिना स्टेम कोशिकाओं के अलगाव एक विशिष्ट बाँझ प्राथमिक संस्कृति प्रयोगों के लिए समर्पित कमरे में किया जाता है. इस प्रक्रिया शुरू करने से पहले विदारक खुर्दबीन और ठंड प्रकाश स्रोत निर्धारित करते हैं, और फिर बाहर बाँझ विदारक उपकरणों रखना. प्रत्येक डाकू कदम के बीच उपकरणों स्टरलाइज़ के लिए एक गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ है.
- हम आँखों से रेटिना स्टेम कोशिकाओं है कि एक बाँझ पेट्री अनुमोदित जानवर नैतिकता प्रोटोकॉल के अनुसार बलिदान चूहों से उनके हटाने के बाद कृत्रिम सेरेब्रल स्पाइनल द्रव (ACSF) युक्त पकवान में रखा गया है तुरंत अलग होगा.
- विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, संदंश के साथ आंख साफ: बाल और संयोजी ऊतक है कि कॉर्निया / scleral सीमा से जुड़ा हुआ है से छुटकारा पाने के. फिर ACSF के साथ एक नया पकवान आँख हस्तांतरण.
- जबकि धीरे दाँतेदार संदंश के साथ स्थिर आँख पकड़, angled सूक्ष्म विदारक कैंची का उपयोग करने के लिए नेत्र की मांसपेशियों को दूर. ऑप्टिक तंत्रिका के रूप में अच्छी तरह से निकालें अगर यह अभी भी आंख के लिए जुड़ा हुआ है. इस प्रक्रिया के दौरान नजर नहीं squish करने की कोशिश करो. ACSF के साथ एक नया पकवान आँखों स्थानांतरण.
- अगला उपयोग घुमावदार सूक्ष्म विदारक कैंची आँख आधे में कटौती: ऑप्टिक तंत्रिका पर शुरू और कॉर्निया के बीच के माध्यम से कटौती, ऑप्टिक तंत्रिका जहां कटौती शुरू किया गया था पर वापस बैठक. यह आदर्श है अगर आंख के दो टुकड़े मोटे तौर पर आकार में बराबर हैं क्योंकि यह अगले कदम आसान हो जाएगा.
- दो संदंश का उपयोग corneas होल्डिंग, दो आंख छील धीरे अलावा आधा. निकालें और लेंस, आंत, और आंख के गोले से तंत्रिका रेटिना त्यागें. ACSF के साथ एक नया पकवान गोले स्थानांतरण.
- अब हम रोमक उपकला को अलग करने के लिए तैयार हैं. शुरू करने के लिए, पूरबी आँख खोल इतना है कि कॉर्निया अपने अधिकार और रेटिना Pigmented उपकला (RPE) पर बाईं तरफ है. धीरे RPE तरफ सीधे संदंश के साथ आँख खोल नीचे पिन.
- अगले, एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए कॉर्निया और परितारिका धीरे स्केलपेल पर नीचे धक्का बजाय काटने का कार्य गतियों का उपयोग करके दूर आँख के सिलिअरी उपकला से कटौती.
- उसके बाद, रोमक उपकला RPE से दूर कटौती. गैर दाँतेदार संदंश का प्रयोग करें एक नई 35 मिमी ACSF युक्त पकवान रोमक उपकला की पट्टी हस्तांतरण.
- उसी तरह, दूसरी आँख खोल से सिलिअरी उपकला अलग.
- एक बार दोनों सिलिअरी उपकला स्ट्रिप्स को एकत्र किया गया है, एक 35 मिमी Dispase की 2 एमएल युक्त डिश में स्ट्रिप्स हस्तांतरण. 10 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्ट्रिप्स के साथ पकवान प्लेस.
- 10 मिनट के बाद, Dispase से फ़िल्टर्ड trypsin, hyaluronidase, और Kynurenic एसिड के 2 एमएल युक्त डिश में स्ट्रिप्स हस्तांतरण. 37 पर पकवान प्लेस ° C 10 मिनट के लिए.
- अब विदारक माइक्रोस्कोप के लिए लौटने. जबकि सीधे संदंश के साथ श्वेतपटल नीचे पकड़े, घुमावदार गैर दाँतेदार संदंश के नीचे का उपयोग करें धीरे रोमक उपकला श्वेतपटल से दूर परिमार्जन.
- श्वेतपटल पकवान से निकालें. सब पकवान में छोड़ दिया जाना चाहिए अब ब्याज और एंजाइम समाधान की कोशिकाओं रहे हैं.
- आग पॉलिश कपास खामियों को दूर विंदुक का प्रयोग, एक 14 मिलीलीटर ट्यूब में इस समाधान को हस्तांतरण. इस समाधान 30 बार Triturate धीरे और विंदुक के समाधान मजबूर द्वारा अलग उपकला कोशिकाओं को तोड़ने के लिए.
- 1500 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र. जब centrifugation किया जाता है, अपकेंद्रित्र से ट्यूब सावधानी से निकाल के बाद से कोशिकाओं को इस स्तर पर बंद ट्यूब के नीचे आने के लिए प्रवण हैं.
- धीरे सतह पर तैरनेवाला के बहुमत आग पॉलिश पिपेट का उपयोग aspirate, और तब सीरम मुक्त मीडिया में कोशिकाओं को trypsin अवरोध करनेवाला का 1 एमएल जोड़ने. एक छोटे borehole कपास खामियों को दूर विंदुक प्रयोग लगभग 50 गुना नमूना triturate जब तक यह एक एकल कोशिका निलंबन है.
- 1500 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए ट्यूब फिर अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और यह अपने चढ़ाना माध्यम से 1 एमएल के साथ की जगह. धीरे Triturate एक गिलास आग पॉलिश पिपेट का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं resuspend.
- गिनती के बादकोशिकाओं की थाली, आईएनजी उन्हें 24 अच्छी तरह से एक थाली में वांछित घनत्व. हम आम तौर पर 10 कोशिकाओं / प्लेट मध्यम प्रत्येक के साथ अच्छी तरह से पहली भरने और फिर सेल निलंबन जोड़ने के लिए मीडिया के 500 μL की अंतिम मात्रा द्वारा μL.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में थाली प्लेस जहां यह जब तक तुम क्षेत्रों है कि 7 दिनों के बाद पैदा होती है गिनती नहीं ले जाया जाएगा.
3. रेटिना स्टेम सेल को अलग करने के परिणाम
- जब इस प्रक्रिया को सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया है, dissected रोमक उपकला कोशिकाओं dissociated और कम घनत्व (चित्रा 1) पर चढ़ाया जा रहा करने के बाद इस तरह दिखना चाहिए.
- संस्कृति में 7 दिनों के बाद, रेटिना स्टेम सेल क्षेत्रों उठता है कि गिना जाता है. 75 सुक्ष्ममापी एक क्षेत्र से अधिक व्यास और मुफ्त के लिए एक स्टेम सेल व्युत्पन्न क्षेत्र के रूप में गिना जा अस्थायी में होना चाहिए. (चित्रा 2). हालांकि, कुछ कोशिकाओं सीमित प्रसार और फार्म spheroids कि आकार कसौटी को पूरा नहीं करते हैं और स्टेम सेल व्युत्पन्न क्षेत्रों के रूप में नहीं गिना जाएगा होगा, इस तरह के एक उपगोल के एक उदाहरण यहाँ दिखाया गया है (चित्रा 2).
4. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1.
चित्रा 2.
Discussion
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे रेटिना माउस आंख 1-3 की रोमक उपकला से स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए . रोमक उपकला की स्ट्रिप्स अलग करने के लिए पद्धति में भिन्नता है, लेकिन एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए एंजाइमों और पद्धति इस प्रोटोकॉल में अनुकूलित किया गया है सकते हैं. यह भी महत्वपूर्ण है कि रोमक उपकला के स्ट्रिप्स पृथक किया गया है कि RPE या कॉर्निया की बड़ी मात्रा में शामिल नहीं है क्योंकि इन क्षेत्रों है कि हर आंख से अलग किया जा सकता है है की कुल संख्या पर एक नकारात्मक प्रभाव पड़ता है प्रकट करते हैं. इसके अलावा, सीरम स्वतंत्र मीडिया है कि हम है कि मूल रूप से मस्तिष्क neurospheres 13 के लिए तैयार की गई थी, रेटिना स्टेम सेल क्षेत्रों से बढ़ के लिए आदर्श है. एक भी यकीन है कि कोशिकाओं के बाद वे मढ़वाया गया है और इनक्यूबेटर में रखा ताकि बढ़ती क्षेत्रों को एक साथ नहीं कुल 14 करते परेशान नहीं कर रहे हैं बनाना चाहिए.
एक बार रेटिना स्टेम कोशिकाओं clonal क्षेत्रों का गठन किया है, वे आंख प्रति स्टेम कोशिकाओं का एक संभावित संख्या प्राप्त करने के लिए गिना जा सकता है. क्षेत्रों तब तो एकल कक्षों में अलग किया जा सकता है और पता लगाने आत्म नवीकरण क्षमताओं के लिए passaged या तंत्रिका रेटिना और RPE वृद्धि कारकों के विभिन्न संयोजनों और / या प्रोटीन के उपयोग के विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में विभेदित.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम लौरा क्लार्क उसे अमूल्य सहायता के लिए धन्यवाद. स्टेम सेल नेटवर्क, CIHR और NIH: यह काम NCE द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi 2000 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Cold Light Source | Carl Zeiss, Inc. | KL1500 | dual arm optic light |
| Curved Mini Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Angled Vannas scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| #7 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | non-serrated |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | straight |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | serrated curved |
| #3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | |
| #10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Dispase | VWR international | CACB354235 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Kynurenic Acid | Sigma-Aldrich | K3375 | 1000 IU |
| Trypsin Inhibitor | Roche Group | 10109878001 | |
| 35 mm dishes | VWR international | CA354235 | |
| 24-well plate | VWR international | CA73521-004 | |
| Cotton-plugged pipettes | VWR international | 14672-400 | fire-polish |
| 14 mL Tubes | Falcon BD | 352057 | Polystyrene |
| Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | ||
| FGF2 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 100 IU |
References
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