Summary
이 비디오에서는, 우리는 마우스 눈 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하고 clonal 망막 분야를 형성하는 문화에서 그들을 성장하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 절연되는 분야는 줄기 세포의 추기경 속성을 가지고 : 자기 갱신과 multipotentiality.
Abstract
성인 마우스 망막 줄기 세포 (RSC)은 포유류의 눈 1,2,3의 ciliary 상피 (CE) 내에서 발견된 드문 정지 세포이다. 모두를 형성 CE가 아닌 색소 내부 및 색소 외부 세포 레이어로 구성되어 있으며, CE에서 단일 색소 세포에서 발생하는 clonal RSC 식민지는 차별화된 수있는 두 색소가 아닌 색소의 세포로 구성되어 있습니다 신경 망막과 RPE 세포의 종류. 분야 내의 모든 세포가 모두 적어도 몇 가지 색소 4가 포함되어 있는지 여부에 대한 논란이있다, 그러나 세포는 여전히 1-3 신경 망막 내에있는 다른 세포 유형을 형성 수 있습니다. 등 양서류와 물고기 종 (种)에서는, 그들의 눈을 그러나, 부상 5시 이후엔 재생 능력이있다, 포유류의 눈은 그런 재생 특성을 보여줍니다 않습니다. 우리는 심지어 부상 후뿐만 아니라 안구 손상의 수리 물리 또는 유전자 모델을 도와 세포의 잠재적인 소스로 그들을 사용하여 생체내에서 줄기 세포를 식별하고 6-8 포유류의 망막 줄기 세포가 정지 유지 메커니즘을 이해하기 위해 추구 9-12 통해 이식. 여기서 우리는 clonal 망막 줄기 세포 분야를 형성하기 위해 마우스 눈에서 ciliary 상피 세포를 분리과 문화에서 그들을 성장하는 방법에 대해 설명합니다. 생체내에있는 줄기 세포에 대한 알려진 마커가 없으므로,이 분야는 prospectively 눈 ciliary 상피 내에 줄기 세포의 인구를 식별하는 유일한 알려진 방법입니다.
Protocol
1. 분석 해 봅시다 솔루션 및 효소 솔루션 준비
- 인공 대뇌 척수 (ACSF)와 미리의 혈청이없는 미디어를 만들어 냉동.
- Kynurenic 산성 (0.2 MG / ML)을 무게와 그것이 쉽게 용해되지 않으므로 미리 37 ° C waterbath에서 힐로 ACSF 10 ML에 디졸브.
- 트립신 (1.33 MG / ML)과 Hyaluronidase (0.67 MG / ML) 한 15 ML 튜브의 위치를 밖으로 무게 필요한 때까지 -20 ° C에서 보관하십시오. 이 튜브에 Kynurenic 산성 솔루션을 추가하고 사용하기 직전 22 μm의 주사기 필터를 사용하여 필터링합니다.
- 트립신 억제제를 달다 (Ovamucoid : 1 MG / ML)과 따뜻한 세럼 - 무료 미디어 및 22μm 주사기 필터를 사용하여 필터에 디졸브.
- FGF2 (10 NG / ML)과 헤파린 (2 μg / ML)이있는 세럼 - 무료 미디어 : 도금 미디어를 확인하십시오.
2. 마우스 아이의 망막 줄기 세포를 분리
- 망막 줄기 세포의 분리는 기본 문화 실험 전용 특정 멸균 실에서 수행됩니다. 전에이 절차를 시작하기 위해 해부 현미경과 추위에 광원을 설정하고, 다음 멸균 해부 악기를 배치. 각 후드 단계 사이에 악기를 살균을 위해 뜨거운 구슬 살균기 있습니다.
- 우리는 승인된 동물 윤리 프로토콜에 따라 희생 생쥐에서 그들의 제거 후 인공 대뇌 척수 (ACSF)를 포함하는 멸균 배양 접시에 바로 배치되었습니다 눈에서 망막 줄기 세포를 분리합니다.
- 해부 현미경, 집게로 시선을 청소 : 머리와 각막 / scleral 국경에 첨부되어 결합 조직의 제거. 다음 ACSF로 새로운 접시에 눈을 전송합니다.
- 부드럽게 톱니 모양의 집게로 고정 시선을 잡고 있지만, 안구 근육을 제거하는 직각 마이크로 해부 가위를 사용합니다. 그것이 아직도 눈에에 연결된 경우뿐만 아니라 시신경을 제거합니다. 이 과정에서 눈에 죽겠어하지보십시오. ACSF있는 새로운 요리에 눈을 전송.
- 다음 사용 곡선 마이크로 해부 가위 절반에 눈을 잘라 : 시신경 시에 시작해서 각막의 중앙을 통해 컷, 컷이 시작되었다 시신경에 다시 회의. 이것은 다음 단계로 쉽게 때문에 안구의 두 가지 크기가 대략 동등한있다면 그것은 이상적입니다.
- 두 눈 껍질 부드럽게 두 개의 집게를 사용하여 각막을 개최하는 것은 따로 반쪽. 제거하고 렌즈, 내장, 그리고 눈 껍질에서 신경 망막을 삭제. ACSF로 새로운 접시에 껍질을 전송합니다.
- 이제 우리는 ciliary 상피를 분리 준비가되어 있습니다. 시작하려면, 오리엔트 눈 쉘은 때문에 각막이 오른쪽과 망막 색소 상피 (RPE)에있는 왼쪽에 있습니다. 부드럽게 RPE 측면에 바로 포셉와 눈 껍질을 핀.
- 다음 부드럽게 메스에 아래로 밀고보다는 제재의 움직임을 사용하여 눈 ciliary 상피에서 떨어진 각막과 홍채를 잘라 메스를 사용합니다.
- 그 후, 멀리 RPE에서 ciliary 상피를 잘라. ACSF을 포함하는 새로운 35 mm 요리에 ciliary 상피의 스트립을 전송하지 않는 톱니 모양의 집게를 사용하십시오.
- 동일한 방식으로, 다른 눈 껍질에서 ciliary 상피를 분리.
- 두 ciliary 상피 스트립이 수집되고 나면, Dispase 2 ML을 포함하는 35 mm 접시에 스트립을 전송하기만하면됩니다. 10 분 동안 37 ° C 배양기에서 스트립과 접시를 놓습니다.
- 십분 후, 여과 트립신, Hyaluronidase, 그리고 Kynurenic 산성 2 ML을 포함하는 요리로 Dispase에서 스트립을 전송. 37 접시를 놓고 ° C를 10 분.
- 이제 해부 현미경으로 돌아갑니다. 스트레이트 집게로 공막엔을 누른 상태에서 부드럽게 떨어져 공막엔에서 ciliary 상피를 긁어 곡선이 아닌 톱니 모양의 집게의 바닥을 사용합니다.
- 접시에서 공막엔를 제거합니다. 이제 접시에 남아있을 것이 모든 관심과 효소 솔루션의 세포 수 있습니다.
- 화재 - 세련된 솜 연결 피펫을 사용하여 14 ML 튜브에이 솔루션을 전송합니다. 부드럽게 피펫의에서 밖으로 솔루션을 강제하여 상피 세포를 분리 휴식이 솔루션을 30 번 씹다.
- 1,500 RPM에서 5 분 동안 원심 튜브. 세포가이 단계에서 튜브의 바닥을오고하는 경향이 있기 때문에 원심 분리가 완료되면 조심스럽게 원심에서 튜브를 제거합니다.
- 부드럽게 불타는 광택 피펫을 사용하여 표면에 뜨는의 대부분을 대기음 다음 세포로 세럼 - 무료 미디어 트립신 억제제 1 ML를 추가합니다. 그것이 단일 세포 현탁액 때까지 약 50 번 샘플을 씹다하는 작은 시추공 솜 연결 피펫을 사용합니다.
- 1,500 RPM에서 5 분 동안 다시 튜브를 원심 분리기.
- 뜨는을 제거하고 도금 매체 1 ML로 바꾸십시오. 세포를 resuspend에 불을 광택 유리 피펫을 사용하여 부드럽게 가루로 빻다.
- 개수 후24 - 잘 판에서 원하는 농도에서 세포, 접시 그들을 주입. 우리는 일반적으로 판 10 세포 / 중간 각 잘 첫번째 입력하고 다음 미디어 500 μL의 최종 볼륨을 얻기 위해 세포 현탁액을 추가하여 μL.
- 당신은 7 일 후 발생하는 분야를 계산하기 전까지 이동되지 않습니다 37 ° C CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다.
3. 망막 줄기 세포를 분리 결과
- 이 절차가 성공적으로 수행되면, 해부 ciliary 상피 세포는 저밀도 (그림 1)에서 dissociated 및 도금 후에 같이한다.
- 문화 7 일 후에 발생하는 망막 줄기 세포 분야가 포함됩니다. 구형은 직경과 줄기 세포 파생된 영역으로 계산하는 자유 부동 75 μm의 이상되어야합니다. (그림 2). 그러나, 일부 세포는 크기의 기준을 충족하지 않으며 줄기 세포 파생된 분야로 계산되지 않습니다 제한된 증식 및 양식 spheroids을 것입니다, 이러한 회전 타원체의 예제는 (그림 2) 여기에 표시됩니다.
4. 대표 결과
그림 1.
그림 2.
Discussion
이 프로토콜은 마우스 눈 1-3의 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. ciliary 상피의 스트립을 격리에 대한 방법론 그러나 단일 세포 현탁액을 달성을위한 효소와 방법론이 프로토콜에 최적화되었습니다, 다를 수 있습니다. 그것은 이러한 각각의 시선에서 격리 수있는 분야의 총 개수에 부정적인 영향을 미칠 것처럼부터 고립되어있다 ciliary 상피의 스트립이 RPE이나 각막의 다량을 포함하지 않는 것이 또한 중요합니다. 또한, 우리가 원래 두뇌 neurospheres 13 공식화 것을 확인하는 혈청이없는 미디어는 망막 줄기 세포 분야의 성장에 이상적입니다. 하나는 그들이 성장하는 분야가 함께 14 집계되지 않도록 도금 및 보육에 배치받은 후 세포가 방해되지 않도록해야합니다.
망막 줄기 세포가 clonal 분야를 형성되면, 그들은 눈 당 줄기 세포의 미래의 수치를 얻기 위해 계산하실 수 있습니다. 분야 다음 다음 단일 셀에 dissociated하고 확인할 자기 갱신 기능을 passaged 또는 다른 성장 요인의 조합 및 / 또는 단백질을 사용하여 신경 망막과 RPE의 서로 다른 세포 유형으로 차별화된 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 그녀의 귀중한 도움 로라 클라크 감사합니다. 줄기 세포 네트워크, CIHR 및 NIH :이 작품은 제정신에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi 2000 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Cold Light Source | Carl Zeiss, Inc. | KL1500 | dual arm optic light |
| Curved Mini Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Angled Vannas scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| #7 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | non-serrated |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | straight |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | serrated curved |
| #3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | |
| #10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Dispase | VWR international | CACB354235 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Kynurenic Acid | Sigma-Aldrich | K3375 | 1000 IU |
| Trypsin Inhibitor | Roche Group | 10109878001 | |
| 35 mm dishes | VWR international | CA354235 | |
| 24-well plate | VWR international | CA73521-004 | |
| Cotton-plugged pipettes | VWR international | 14672-400 | fire-polish |
| 14 mL Tubes | Falcon BD | 352057 | Polystyrene |
| Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | ||
| FGF2 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 100 IU |
References
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