Summary
En este video, vamos a demostrar cómo aislar las células madre de la retina del epitelio ciliar del ojo del ratón y hacer crecer en cultivo de forma clonal esferas de retina. Las esferas que se encuentran aisladas poseen las propiedades cardinales de las células madre: la auto-renovación y multipotencialidad.
Abstract
La célula madre de la retina de ratones adultos (RSC) es una célula poco de reposo se encuentran en el epitelio ciliar (CE) del ojo de los mamíferos 1,2,3. La CE está compuesto por no pigmentados capas de células pigmentadas interior y exterior, y las colonias clonal RSC que surgen de una sola célula pigmentada de la CE se compone de dos células pigmentadas y no pigmentadas que se pueden diferenciar para formar todos los tipos de células de la retina neural y el EPR. Existe cierta controversia sobre si todas las células dentro de las esferas contienen al menos algo de pigmento 4, pero las células son todavía capaces de formar los tipos de células diferentes que se encuentran dentro de la retina neural 1-3. En algunas especies, como los anfibios y los peces, sus ojos son capaces de regenerarse después de una lesión 5, sin embargo, el ojo de los mamíferos no muestra propiedades regenerativas tales. Tratamos de identificar las células madre in vivo y para comprender los mecanismos que impiden que las células madre de la retina de mamíferos en reposo 6-8, incluso después de la lesión, así como su uso como una fuente potencial de células para ayudar a reparar los modelos físicos o genéticos de la lesión en el ojo a través del trasplante 9-12. Aquí se describe cómo aislar las células epiteliales ciliar del ojo del ratón y hacer crecer en cultivo con el fin de formar la retina esferas clonal de células madre. Dado que no existen marcadores conocidos de las células madre in vivo, estos ámbitos son la única forma conocida para identificar de manera prospectiva la población de células madre en el epitelio ciliar del ojo.
Protocol
1. Prepare las soluciones de disección y soluciones enzimáticas
- Hacer que el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) y los medios de comunicación libre de suero antes de tiempo y refrigere.
- Pesar el ácido quinurénico (0,2 mg / ml) y se disuelven en 10 ml de hilo ACSF en un baño de agua a 37 ° C antes de tiempo, ya que no se disuelven fácilmente.
- Pesar de la tripsina (1,33 mg / ml) y hialuronidasa (0,67 mg / ml) y colocar en un tubo de 15 ml y mantener a -20 ° C hasta que se necesite. Añadir la solución de ácido quinurénico a este tubo y el filtro usando un filtro de 22 micras jeringa justo antes de su uso.
- Pesar inhibidor de tripsina (Ovamucoid: 1 mg / ml) y se disuelven en agua tibia medio libre de suero y el filtro con filtro de jeringa de 22μm.
- Hacen los medios de recubrimiento: medio libre de suero que contiene FGF2 (10 ng / ml) y heparina (2 mg / mL).
2. Aislar las células madre de la retina del ojo del ratón
- El aislamiento de las células madre de la retina se realiza en una sala específica estéril dedicado a los experimentos de cultivo primario. Antes de iniciar este procedimiento, configure el microscopio de disección y la fuente de luz fría, y luego diseñar los instrumentos de disección estéril. Cada campana tiene un esterilizador de calor para la esterilización de cuentas de los instrumentos entre los pasos.
- Vamos a aislar las células madre de la retina de los ojos que se han colocado de inmediato en una placa de Petri estéril que contiene el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) después de su eliminación de los ratones sacrificados de acuerdo a protocolos aprobados ética animal.
- Bajo el microscopio de disección, limpia los ojos con unas pinzas: deshacerse del pelo y el tejido conectivo que se une a la córnea / frontera escleral. A continuación, traslado a los ojos a un nuevo plato con ACSF.
- Mientras que suavemente manteniendo el ojo fijo con unas pinzas dentadas, usar un ángulo de micro-disección de tijeras para cortar los músculos oculares. Quitar el nervio óptico y si todavía está conectado a la vista. Trate de no aplastar a los ojos durante el proceso. La transferencia de los ojos a un nuevo plato con ACSF.
- Siguiente uso de micro-disección curvas tijeras para cortar el ojo en la mitad: comienzan en el nervio óptico y cortar por el centro de la córnea, encuentro de vuelta en el nervio óptico, donde se inició el corte. Lo ideal es que las dos partes del ojo son más o menos equivalente en tamaño, ya que esto hará que el siguiente paso sea más fácil.
- La celebración de las córneas con dos pinzas, suavemente pelar el ojo dos mitades. Retire y deseche las lentes, las vísceras, y la retina neural de las conchas de los ojos. Transferencia de las conchas de un nuevo plato con ACSF.
- Ahora estamos listos para aislar el epitelio ciliar. Para comenzar, orientar la cáscara del ojo para que la córnea está a su derecha y el epitelio pigmentado retiniano (EPR) está a la izquierda. Suavemente la capa pin vista hacia abajo con una pinza recta en el lado del EPR.
- A continuación, utiliza un bisturí para cortar la córnea y el iris lejos del epitelio ciliar del ojo presionando suavemente sobre el bisturí en lugar de utilizar los movimientos de aserrado.
- Después de eso, cortar el epitelio ciliar lejos de la RPE. Use unas pinzas dentadas no a la transferencia de la franja de epitelio ciliar a una nueva de 35 mm plato que contiene ACSF.
- De la misma manera, aislar el epitelio ciliar de la cáscara del otro ojo.
- Una vez que ambas bandas del epitelio ciliar se han recogido, la transferencia de las tiras en una placa de 35 mm que contiene 2 ml de Dispasa. Coloque el plato con las tiras en una incubadora a 37 ° C durante 10 minutos.
- Después de 10 minutos, la transferencia de las tiras de la Dispasa en un plato que contiene 2 ml de tripsina filtrada, hialuronidasa y ácido quinurénico. Coloque el plato a 37 ° C durante 10 minutos.
- Ahora regresa a la microscopio de disección. Mientras mantiene la esclerótica hacia abajo con pinzas rectas, el uso de la parte inferior de la curva no dentada pinzas para raspar suavemente el epitelio ciliar lejos de la esclerótica.
- Retire la esclerótica del plato. Todo lo que se debe dejar en el plato ahora son las células de interés y la solución enzimática.
- El uso de un pulido al fuego de algodón conectado pipeta, transferir esta solución en un tubo de 14 ml. Triturar esta solución 30 veces para romper las células epiteliales con cuidado pasar la solución dentro y fuera de la pipeta.
- Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 1500 RPM. Cuando se hace la centrifugación, sacar el tubo de la centrífuga con cuidado ya que las células son propensos a la que salió de la parte inferior del tubo en esta etapa.
- Aspire con cuidado la mayor parte de el sobrenadante con una pipeta pulida al fuego, y luego agregar 1 ml de inhibidor de tripsina en el medio libre de suero de las células. Use un pequeño algodón conectado pozo pipeta para triturar la muestra de aproximadamente 50 veces hasta que es una suspensión de una sola célula.
- Centrifugar el tubo de nuevo durante 5 minutos a 1500 RPM.
- Eliminar el sobrenadante y reemplazarlo con 1 ml de medio de galvanoplastia. Triturar suavemente con una pipeta de vidrio pulido al fuego para volver a suspender la ceLLS.
- Después de contar las células, las placas a la densidad deseada en una placa de 24 pocillos. Por lo general, la placa de 10 células / mm llenando cada primer pozo en medio y luego añadir la suspensión celular para obtener un volumen final de 500 l de los medios de comunicación.
- Colocar la placa en un 37 ° C incubadora de CO 2 en los que no se moverán hasta que se cuentan las esferas que surgen después de 7 días.
3. Los resultados de aislamiento de células madre de la retina
- Cuando este procedimiento se realiza con éxito, la disección células epiteliales ciliares debería tener este aspecto después de haber sido disociadas y chapada a la baja densidad (Figura 1).
- Después de 7 días en la cultura, las esferas de células madre de la retina que se plantean son contados. Una esfera debe ser más de 75 micras de diámetro y de libre flotación para ser considerado como una esfera de células madre derivadas. (Figura 2). Sin embargo, algunas células se han esferoides limitado la proliferación y la forma de que no cumplen con el criterio de tamaño y no se contará como esferas de células madre derivadas; un ejemplo de un esferoide se muestra a continuación (Figura 2).
4. Resultados representante
Figura 1.
Figura 2.
Discussion
Este protocolo describe cómo aislar las células madre de la retina del epitelio ciliar del ojo con el ratón 3.1. La metodología para el aislamiento de las tiras de epitelio ciliar puede variar, sin embargo, las enzimas y la metodología para la consecución de una suspensión de una sola célula han sido optimizados en este protocolo. También es importante que las tiras de epitelio ciliar que han sido aisladas no contienen grandes cantidades de RPE o de la córnea, ya que estos parecen tener un impacto negativo en el número total de esferas que pueden ser aislados de cada ojo. Además, los medios de comunicación libres de suero que hacemos que se formuló originalmente para el cerebro neuroesferas 13, es ideal para el cultivo de la retina esferas de células madre. También hay que asegurarse de que las células no se alteran después de que se han plateado y se colocan en la incubadora para que los ámbitos de crecimiento no se agregan juntos 14.
Una vez que las células madre de la retina se han formado las esferas clonal, que se puede contar para obtener un número potencial de células madre por ojo. Las esferas se pueden disociarse en células individuales y se pasaron a conocer la renovación capacidades de auto-o diferenciarse en diferentes tipos de células de la retina neural y el EPR usando diferentes combinaciones de factores de crecimiento y / o proteínas.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Laura Clarke por su inestimable ayuda. Este trabajo es apoyado por la economía neoclásica: la Red de Células Madre, CIHR y los NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi 2000 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Cold Light Source | Carl Zeiss, Inc. | KL1500 | dual arm optic light |
| Curved Mini Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Angled Vannas scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| #7 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | non-serrated |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | straight |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | serrated curved |
| #3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | |
| #10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Dispase | VWR international | CACB354235 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Kynurenic Acid | Sigma-Aldrich | K3375 | 1000 IU |
| Trypsin Inhibitor | Roche Group | 10109878001 | |
| 35 mm dishes | VWR international | CA354235 | |
| 24-well plate | VWR international | CA73521-004 | |
| Cotton-plugged pipettes | VWR international | 14672-400 | fire-polish |
| 14 mL Tubes | Falcon BD | 352057 | Polystyrene |
| Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | ||
| FGF2 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 100 IU |
References
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